Herstellung von 3D-Cardiac Microtissue Arrays unter Verwendung von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten, kardialen Fibroblasten und Endothelzellen
Summary
Hier beschreiben wir eine einfach zu bedienende Methodik zur Erzeugung von 3D-selbstorganisierten kardialen Mikrogewebe-Arrays, die aus vordifferenzierten humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten, Herzfibroblasten und Endothelzellen bestehen. Diese benutzerfreundliche und zellarme Technik zur Erzeugung kardialer Mikrogewebe kann für die Krankheitsmodellierung und frühe Stadien der Arzneimittelentwicklung implementiert werden.
Abstract
Die Erzeugung von humanen Kardiomyozyten (CMs), kardialen Fibroblasten (CFs) und Endothelzellen (ECs) aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) bot eine einzigartige Gelegenheit, das komplexe Zusammenspiel zwischen verschiedenen kardiovaskulären Zelltypen zu untersuchen, das die Gewebeentwicklung und -krankheit antreibt. Im Bereich der Herzgewebemodelle verwenden mehrere ausgeklügelte dreidimensionale (3D) Ansätze induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (iPSC-CMs), um die physiologische Relevanz und die native Gewebeumgebung mit einer Kombination aus extrazellulären Matrizen und Vernetzern nachzuahmen. Diese Systeme sind jedoch ohne Mikrofabrikationskenntnisse komplex herzustellen und benötigen mehrere Wochen für die Selbstmontage. Am wichtigsten ist, dass vielen dieser Systeme Gefäßzellen und Herzfibroblasten fehlen, die über 60% der Nichtmyozyten im menschlichen Herzen ausmachen. Hier beschreiben wir die Ableitung aller drei Herzzelltypen aus iPS-Zellen zur Herstellung kardialer Mikrogewebe. Diese einfache Replik-Formgebungstechnik ermöglicht die kardiale Mikrobearbeitungskultur in Standard-Multi-Well-Zellkulturplatten für mehrere Wochen. Die Plattform ermöglicht eine benutzerdefinierte Kontrolle über Mikrogewebegrößen basierend auf der anfänglichen Seeding-Dichte und benötigt weniger als 3 Tage für die Selbstorganisation, um beobachtbare kardiale Mikrogewebekontraktionen zu erreichen. Darüber hinaus können die kardialen Mikrogewebe leicht verdaut werden, während eine hohe Zelllebensfähigkeit für die Einzelzellbefragung unter Verwendung von Durchflusszytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) erhalten bleibt. Wir stellen uns vor, dass dieses In-vitro-Modell von kardialen Mikrogeweben dazu beitragen wird, Validierungsstudien in der Arzneimittelentdeckung und Krankheitsmodellierung zu beschleunigen.
Introduction
Die Wirkstoffforschung und Krankheitsmodellierung im Bereich der kardiovaskulären Forschung steht aufgrund des Mangels an klinisch relevanten Proben und unzureichender translationaler Werkzeuge vor mehreren Herausforderungen1. Hochkomplexe präklinische Modelle oder stark vereinfachte in vitro Einzelzellmodelle zeigen keine pathophysiologischen Bedingungen in reproduzierbarer Weise. Daher haben sich mehrere miniaturisierte Tissue-Engineering-Plattformen entwickelt, um die Lücke zu schließen, mit dem Ziel, ein Gleichgewicht zwischen einfacher Anwendung in hochdurchsatziger Weise und einer getreuen Rekapitulation der Gewebefunktion zu erreichen2,3. Mit dem Aufkommen der Technologie der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) können Tissue-Engineering-Werkzeuge auf patientenspezifische Zellen mit oder ohne zugrunde liegenden Kardioerkrankungen angewendet werden, um Forschungsfragen zu beantworten4,5,6. Solche Gewebemodelle mit einer zellulären Zusammensetzung, die dem Herzgewebe ähnelt, könnten in der Arzneimittelentwicklung verwendet werden, um auf Kardiotoxizität und Dysfunktion zu testen, die durch pathologische Verhaltensänderungen eines oder mehrerer Zelltypen induziert werden.
Selbstorganisierte Mikrogewebe oder Organoide, die von menschlichen iPS-Zellen abgeleitet sind, sind dreidimensionale (3D) Strukturen, bei denen es sich um gewebeähnliche Miniaturanordnungen handelt, die funktionelle Ähnlichkeiten mit ihren In-vivo-Gegenstücken aufweisen. Es gibt verschiedene Ansätze, die die Bildung von Organoiden in situ durch gerichtete Differenzierung von iPS-Zellen oder durch die Bildung von embryoiden Körpern ermöglichen4. Die resultierenden Organoide sind ein unverzichtbares Werkzeug, um morphogenetische Prozesse zu untersuchen, die die Organogenese antreiben. Das Vorhandensein einer Vielzahl von Zellpopulationen und Unterschiede in der Selbstorganisation können jedoch zu einer Variabilität der Ergebnisse zwischen verschiedenen Organoiden führen5. Alternativ sind vordifferenzierte Zellen, die selbst zu Mikrogeweben mit gewebespezifischen Zelltypen zusammengesetzt sind, um lokale Zell-Zell-Interaktionen zu untersuchen, hervorragende Modelle, bei denen es möglich ist, die selbstorganisierten Komponenten zu isolieren. Insbesondere in der humanen Herzforschung hat sich die Entwicklung von 3D-Herzmikrogeweben mit mehrzelligen Komponenten als Herausforderung erwiesen, wenn Zellen aus verschiedenen Patientenlinien oder kommerziellen Quellen gewonnen werden.
Um unser mechanistisches Verständnis des Zellverhaltens in einem physiologisch relevanten, personalisierten In-vitro-Modell zu verbessern, sollten idealerweise alle Komponentenzelltypen aus derselben Patientenlinie abgeleitet werden. Im Kontext eines menschlichen Herzens würde ein wirklich repräsentatives kardiales In-vitro-Modell das Crosstalk zwischen vorherrschenden Zelltypen erfassen, nämlich Kardiomyozyten (CMs), Endothelzellen (ECs) und Herzfibroblasten (CFs)6,7. Die originalgetreue Rekapitulation eines Myokards erfordert nicht nur biophysikalische Dehnung und elektrophysiologische Stimulation, sondern auch Zell-Zell-Signale, die von unterstützenden Zelltypen wie ECs und CFs8 ausgehen. CFs sind an der Synthese der extrazellulären Matrix und der Aufrechterhaltung der Gewebestruktur beteiligt; und in einem pathologischen Zustand können CFs Fibrose induzieren und die elektrische Leitung im CMs9 verändern. In ähnlicher Weise können ECs die kontraktilen Eigenschaften von CMs durch parakrine Signalgebung regulieren und lebenswichtige Stoffwechselanforderungen liefern10. Daher besteht ein Bedarf an humanen kardialen Mikrogeweben, die aus allen drei Hauptzelltypen bestehen, um physiologisch relevante Hochdurchsatzexperimente durchführen zu können.
Hier beschreiben wir einen Bottom-up-Ansatz bei der Herstellung von kardialen Mikrogeweben durch Ableitung von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten (iPSC-CMs), iPSC-abgeleiteten Endothelzellen (iPSC-ECs) und iPSC-abgeleiteten kardialen Fibroblasten (iPSC-CFs) und ihrer 3D-Kultur in einheitlichen kardialen Mikrogewebe-Arrays. Diese einfache Methode zur Erzeugung spontan schlagender kardialer Mikrogewebe kann für die Krankheitsmodellierung und das schnelle Testen von Medikamenten zum funktionellen und mechanistischen Verständnis der Herzphysiologie verwendet werden. Darüber hinaus könnten solche mehrzelligen kardialen Mikrogewebeplattformen mit Genom-Editing-Techniken genutzt werden, um das Fortschreiten der Herzkrankheit im Laufe der Zeit unter chronischen oder akuten Kulturbedingungen nachzuahmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um kardiale Mikrogewebe aus vordifferenzierten iPSC-CMs, iPSC-ECs und iPSC-CFs zu erzeugen, ist es unerlässlich, eine hochreine Kultur zur besseren Kontrolle der Zellzahlen nach kontaktinhibierter Zellverdichtung innerhalb der kardialen Mikrogewebe zu erhalten. Kürzlich haben Giacomelli et. al.18 haben die Herstellung von kardialen Mikrogeweben unter Verwendung von iPSC-CMs, iPSC-ECs und iPSC-CFs demonstriert. Kardiale Mikrogewebe, die mit der beschriebenen Methode erzeugt werden, bestehen aus ~…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Amanda Chase für ihr hilfreiches Feedback zum Manuskript. Finanzielle Unterstützung wurde durch das Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) der University of California, T29FT0380 (D.T.) und 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) und 17MERIT33610009 (J.C.W.); und National Institutes of Health (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 und NIH UH3 TR002588 (J.C.W).
Materials
| 12-well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 3D micro-molds | Microtissues | 12-81 format | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| AutoMACS Rinsing Solution | Thermo Fisher Scientific | NC9104697 | |
| B27 Supplement minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B27 Supplement plus Insulin | Life Technologies | 17504-044 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Cardiac Troponin T Antibody | Miltenyi | 130-120-403 | |
| CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads | Miltenyi | 130-097-857 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi | 130-110-670 | |
| CD31 Microbeads | Miltenyi | 130-091-935 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DDR2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-81707 | |
| Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI | Thermo Fisher Scientific | V13242 | |
| Dispase I | Millipore Sigma | 4942086001 | |
| DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium | 11960044 | ||
| DMEM/F-12 basal medium | Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| EGM2 BulletKit | Lonza | CC-3124 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit | LifeLIne Cell Technology | LS-1010 | |
| Glucose free RPMI medium | Life Technologies | 11879-020 | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Human FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | 13256029 | |
| Human VEGF-165 | PeproTech | 100-20 | |
| IWR-1-endo | Selleckchem | S7086 | |
| Liberase TL | Millipore Sigma | 5401020001 | |
| LS Sorting Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS BSA Stock solution | Miltenyi | 130-091-376 | |
| MACS Rinsing Buffer | Miltenyi | 130-091-222 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | |
| RPMI medium | Life Technologies | 11835055 | |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | |
| TO-PRO 3 | Thermo Fisher Scientific | R37170 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | X100-100ML | |
| TrypLE Select 10X | Thermo Fisher Scientific | red | |
| Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody | R&D Systems | IC2105G |
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