ייצור מערכי מיקרוטיסו לב תלת-ממדיים באמצעות קרדיומיוציטים אנושיים שמקורם ב-IPSC, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל
Summary
כאן, אנו מתארים מתודולוגיה קלה לשימוש כדי ליצור מערכי מיקרוטיסו לבביים תלת-ממדיים בהרכבה עצמית המורכבים מקרדיומיוציטים פלואוריפוטנטיים מובחנים מראש המושרים על ידי בני אדם, קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל. תא זה ידידותי למשתמש ונמוך הדורש טכניקה כדי ליצור microtissues לב ניתן ליישם עבור מידול מחלות ושלבים מוקדמים של פיתוח תרופות.
Abstract
דור של קרדיומיוציטים אנושיים (CMs), פיברובלסטים לבביים (CFs) ותאי אנדותל (ECs) מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (IPSCs) סיפק הזדמנות ייחודית לחקור את יחסי הגומלין המורכבים בין סוגי תאים לב וכלי דם שונים המניעים התפתחות רקמות ומחלות. בתחום המודלים של רקמת לב, מספר גישות תלת-ממדיות מתוחכמות (3D) משתמשות בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים (iPSC-CMs) כדי לחקות רלוונטיות פיזיולוגית וסביבת רקמות מקומית עם שילוב של מטריצות חוץ-תאיות וקישורים צולבים. עם זאת, מערכות אלה מורכבות כדי לפברק ללא מומחיות microfabrication ודורשים מספר שבועות כדי להרכיב את עצמם. והכי חשוב, לרבות ממערכות אלה חסרים תאי כלי דם ופיברובלסטים לבביים המהווים מעל 60% מהלא-מיוציטים בלב האדם. כאן אנו מתארים את ההפקה של כל שלושת סוגי תאי הלב מ- IPSCs כדי לפברק מיקרוטיסות לב. טכניקת דפוס העתקים קלה זו מאפשרת תרבות מיקרוטיסו לבבית בלוחות תרבית תאים רב-תאיים סטנדרטיים במשך מספר שבועות. הפלטפורמה מאפשרת שליטה מוגדרת על ידי המשתמש בגדלים microtissue בהתבסס על צפיפות זריעה ראשונית ודורש פחות מ 3 ימים להרכבה עצמית כדי להשיג התכווצויות microtisue לב נצפה. יתר על כן, microtissues הלב ניתן לעיכול בקלות תוך שמירה על כדאיות גבוהה של תאים לחקירה של תא יחיד עם שימוש ציטומטריית זרימה ורצף RNA חד-תאי (scRNA-seq). אנו חוזים כי מודל הפריה חוץ גופית זה של מיקרוטיסויות לב יסייע להאיץ מחקרי אימות בגילוי תרופות ומודלים של מחלות.
Introduction
גילוי תרופות ומודלים של מחלות בתחום המחקר הקרדיווסקולרי מתמודדים עם מספר אתגרים בשל מחסור בדגימות רלוונטיות קלינית וכלים תרגומיים לקויים1. מודלים פרה-קליניים מורכבים ביותר או מודלים פשטניים יתר על המידה במבחנה של תאים חד-תאיים אינם מציגים תנאים פתופיזיולוגיים באופן ניתן לשחזור. לכן, מספר פלטפורמות ממוזערות מהונדסות רקמות התפתחו כדי לעזור לגשר על הפער, במטרה להשיג איזון בין קלות היישום באופן בעל תפוקה גבוהה לבין תקציר נאמן של תפקוד הרקמה2,3. עם הופעתה של טכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים (iPSC), ניתן ליישם כלים להנדסת רקמות על תאים ספציפיים למטופל עם או בלי מחלות לב וכלי דם בסיסיות כדי לענות על שאלות מחקר4,5,6. מודלים מהונדסים רקמות כאלה עם הרכב תאי דומה רקמת הלב יכול להיות מנוצל במאמצי פיתוח תרופות כדי לבדוק cardiotoxicity וחוסר תפקוד הנגרמים על ידי שינויים פתולוגיים בהתנהגות של סוג תא אחד או מרובים.
מיקרוטיסואים או אורגנוידים בהרכבה עצמית שמקורם ב-IPSCs אנושיים הם מבנים תלת-ממדיים (3D) שהם מכלולים זעירים דמויי רקמות המציגים קווי דמיון פונקציונליים למקביליהם ב-vivo . ישנן מספר גישות שונות המאפשרות היווצרות של organoids במקום באמצעות הבחנה מכוונת של iPSCs או באמצעות היווצרות של גופים עובריים4. האורגנוידים המתקבלים הם כלי הכרחי לחקר תהליכים מורפוגנטיים המניעים אורגנוגנזה. עם זאת, נוכחות של מגוון רחב של אוכלוסיות תאים והבדלים בארגון עצמי יכול להוביל לשונות בתוצאות בין organoids שונים5. לחלופין, תאים מובחנים מראש כי הם מורכבים עצמית לתוך microtissues עם סוגי תאים ספציפיים לרקמות כדי ללמוד אינטראקציות תא מקומיות הם מודלים מצוינים, שבו זה אפשרי לבודד את הרכיבים בהרכבה עצמית. במיוחד במחקר לב אנושי, פיתוח של microtissues לב 3D עם רכיבים רב תאיים הוכיח להיות מאתגר כאשר תאים נגזרים מקווי חולים שונים או מקורות מסחריים.
כדי לשפר את ההבנה המכניסטית שלנו של התנהגויות תאים במודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, מותאם אישית, במבחנה, באופן אידיאלי כל סוגי התאים המרכיבים צריכים להיגזר מאותו קו מטופל. בהקשר של לב אנושי, מודל מבחנה לב מייצג באמת יתפוס את השיח הצולב בין סוגי תאים דומיננטיים, כלומר, קרדיומיוציטים (CMs), תאי אנדותל (ECs) ופיברובלסטים לבביים (CFs)6,7. הסיכום הנאמן של שריר הלב לא רק דורש מתיחה ביופיסית וגירוי אלקטרופיזיולוגי, אלא גם איתות תאי-תא הנובעים מסוגי תאים תומכים כגון ECs ו- CFs8. CFs מעורבים בסינתזה של מטריצה חוץ-תאית ושמירה על מבנה הרקמות; ובמצב פתולוגי, CFs יכול לגרום פיברוזיס ולשנות הולכה חשמלית ב- CMs9. באופן דומה, ECs יכול לווסת תכונות התכווצות של CMs באמצעות איתות paracrine ואספקת דרישות מטבוליות חיוניות10. לפיכך, יש צורך במיקרוטיסות לב אנושיות המורכבות מכל שלושת סוגי התאים העיקריים כדי לאפשר ניסויים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית לתפוקה גבוהה להתבצע.
כאן, אנו מתארים גישה מלמטה למעלה בייצור של microtissues לב על ידי נגזרת של קרדיומיוציטים שמקורם IPSC אנושי (iPSC-CMs), תאי אנדותל שמקורם IPSC (iPSC-ECs), ופיברובלסטים לב נגזר IPSC (iPSC-CFs) ואת התרבות התלת-ממדית שלהם במערכים מיקרוטיזיים לב אחידים. שיטה קלה זו של יצירת מיקרוטיסו לב פועם באופן ספונטני ניתן להשתמש עבור מודלים מחלות ובדיקה מהירה של תרופות להבנה פונקציונלית ומכאניסטית של פיזיולוגיה של הלב. יתר על כן, פלטפורמות מיקרוטיסו לב רב-תאיות כאלה יכולות להיות מנוצלות בטכניקות עריכת גנום כדי לחקות התקדמות מחלות לב לאורך זמן בתנאי תרבות כרוניים או חריפים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי ליצור microtissues לב מ iPSC-CMs מובחנים מראש, iPSC-ECs, ו- iPSC-CFs, זה חיוני כדי להשיג תרבות טהורה מאוד לשליטה טובה יותר של מספרי תאים לאחר דחיסת תאים מעוכבים במגע בתוך microtissues הלב. לאחרונה, ג’אקומלי ואח’. al.18 הדגימו את הייצור של מיקרוטיסויות לב באמצעות iPSC-CMs, iPSC-ECs, ו- iPSC-CFs. מיקרוטיזות לב שנוצרו …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר אמנדה צ’ייס על המשוב המועיל שלה על כתב היד. תמיכה במימון ניתנה על ידי התוכנית לחקר מחלות הקשורות לטבק (TRDRP) של אוניברסיטת קליפורניה, T29FT0380 (D.T. ) ו 27IR-0012 (J.C.W.); איגוד הלב האמריקאי 20POST35210896 (H.K.) ו 17MERIT33610009 (J.C.W.); ומכוני הבריאות הלאומיים (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 ו- NIH UH3 TR002588 (J.C.W).
Materials
| 12-well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 3D micro-molds | Microtissues | 12-81 format | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| AutoMACS Rinsing Solution | Thermo Fisher Scientific | NC9104697 | |
| B27 Supplement minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B27 Supplement plus Insulin | Life Technologies | 17504-044 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Cardiac Troponin T Antibody | Miltenyi | 130-120-403 | |
| CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads | Miltenyi | 130-097-857 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi | 130-110-670 | |
| CD31 Microbeads | Miltenyi | 130-091-935 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DDR2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-81707 | |
| Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI | Thermo Fisher Scientific | V13242 | |
| Dispase I | Millipore Sigma | 4942086001 | |
| DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium | 11960044 | ||
| DMEM/F-12 basal medium | Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| EGM2 BulletKit | Lonza | CC-3124 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit | LifeLIne Cell Technology | LS-1010 | |
| Glucose free RPMI medium | Life Technologies | 11879-020 | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Human FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | 13256029 | |
| Human VEGF-165 | PeproTech | 100-20 | |
| IWR-1-endo | Selleckchem | S7086 | |
| Liberase TL | Millipore Sigma | 5401020001 | |
| LS Sorting Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS BSA Stock solution | Miltenyi | 130-091-376 | |
| MACS Rinsing Buffer | Miltenyi | 130-091-222 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | |
| RPMI medium | Life Technologies | 11835055 | |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | |
| TO-PRO 3 | Thermo Fisher Scientific | R37170 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | X100-100ML | |
| TrypLE Select 10X | Thermo Fisher Scientific | red | |
| Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody | R&D Systems | IC2105G |
References
- Neofytou, E., O’Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 156166 (2018).
- Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. Engineering stem cell organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
- Kurokawa, Y. K., George, S. C. Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening. Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).
- Cartledge, J. E., et al. Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators. Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).
- Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues. Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).
- Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).
- Huebsch, N., et al. Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales. Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Gu, M., et al. Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism. European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).
- Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
- Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. , 1-7 (2020).
- Zhang, H., et al. Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis. Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).
- Zhang, J., et al. Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).
- Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
- Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
- Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).
- Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).
- Gu, M. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells. Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64 (2018).
- Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).
- Wessels, A., et al. Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart. Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).
- Ali, S. R., et al. Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation. Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).
- McMurtrey, R. J. Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).
- Thomas, D., O’Brien, T., Pandit, A. Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies. Advanced Materials. 30 (1), 1703948 (2018).
- Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies. Front Pharmacol. 12, 39 (2021).
- Rhee, J. -. W., et al. Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (2), 107886 (2020).
- Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).
- Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models. Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).
- Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).
- Sala, L., et al. Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).
