אפנון מולקולרי על ידי shRNA ספציפי המועבר על ידי לנטיוירוס בנוירונים סטרס ברשתית האנדופלסמית
Summary
במחקר הנוכחי, הביטוי מופל משני מרכיבי איתות במורד הזרם של מסלול PERK, הקלצינוירין הציטופרוטקטיבי וה- CHOP הפרו-אפופטוטי, באמצעות shRNA ספציפי. בדרכים הפוכות, אלה מווסתים את הרגישות של נוירונים קליפת המוח הראשוניים לניוון עצבי לאחר השראת מתח רשתית אנדופלסמית.
Abstract
הצטברות של חלבונים מקופלים בתוך הרשתית האנדופלסמית (ER), הנגרמת על ידי כל מצב לחץ, מפעילה את תגובת החלבון המקופלת (UPR) באמצעות הפעלת חיישנים מיוחדים. UPR מנסה תחילה לשחזר הומאוסטזיס; אבל אם הנזק נמשך, האיתות גורם לאפופטוזיס.
ישנן ראיות הולכות וגדלות לכך שלחץ מתמשך ובלתי פתור בחדר המיון תורם למצבים פתולוגיים רבים, כולל מחלות נוירודגנרטיביות. מכיוון שה-UPR שולט בגורל התא על ידי מעבר בין תהליכים ציטופרוטגונטיים ואפופטוטיים, חיוני להבין את האירועים המגדירים את המעבר הזה, כמו גם את האלמנטים המעורבים במודולציה שלו.
לאחרונה הדגמנו כי הצטברות חריגה של גנגליוזיד GM2 גורמת לדלדול תכולת ER Ca2+ , שבתורה מפעילה את PERK (PKR-like-ER kinase), אחד מחיישני ה-UPR. יתר על כן, איתות PERK משתתף בניוון הנויריטים ובאפופטוזיס המושרה על ידי הצטברות GM2. מבחינה זו, הקמנו מערכת ניסיונית המאפשרת לנו לווסת מולקולרית את הביטוי של רכיבי PERK במורד הזרם ובכך לשנות את הפגיעות של נוירונים לעבור ניוון עצבי.
ביצענו הפלה של ביטוי calcineurin (cytoprotective) ו-CHOP (פרו-אפופטוטי) בתרביות נוירונים בקליפת המוח של חולדות. התאים נדבקו ב-shRNA ספציפי המועבר על ידי לנטיוירוס ולאחר מכן טופלו ב-GM2 בזמנים שונים, תוקנו והוכתמו במערכת החיסון באמצעות נוגדן אנטי-MAP2 (חלבון 2 הקשור למיקרו-צינוריות). מאוחר יותר, תמונות תאים הוקלטו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי וצמיחת נוירוט כוללת הוערכה באמצעות תוכנת עיבוד התמונה ImageJ הנחלת הכלל. עיכוב הביטוי של אותם רכיבי איתות PERK איפשר בבירור להאיץ או לעכב את הניוון העצבי הנגרם על ידי לחץ במיון.
גישה זו עשויה לשמש במודלים של מערכת התא של עקה בחדר מיון כדי להעריך את פגיעותם של נוירונים לניוון עצבים.
Introduction
לחץ רשתית אנדופלסמית (ER) מוגדר ככל הפרעה הפוגעת ביכולת קיפול החלבון באברון. הצטברות החלבונים המקופלים בתוך לומן המיון מפעילה אות מפל התמרה הנקרא תגובת חלבון מקופלת (UPR). מסלול איתות מורכב זה מתוזמר על ידי שלושה חיישני מאמץ: PERK (חלבון קינאז RNA [PKR]-like ER kinase), IRE1 (אנזים הדורש אינוסיטול 1) ו-ATF6 (גורם שעתוק מופעל 6). כולם יחד מנסים לשחזר את ההומאוסטזיס. אבל אם הלחץ נמשך, UPR בסופו של דבר גורם למוות תאי על ידי אפופטוזיס1.
PERK, חלבון טרנסממברנה של ER, על לחץ ER, מוביל את הזרחן של גורם החניכה האיקריוטי-2 אלפא (eIF2α), ומפחית את סינתזת החלבונים הגלובלית ובכך את עומס החלבונים ב- ER2. הראינו כי calcineurin A/B (CNA/B), הטרודימר Ca2+ phosphatase, קושר ישירות את התחום הציטוסולי של PERK, מגביר את הזרחן העצמי שלו ומשפר באופן משמעותי את עיכוב תרגום החלבונים ואת כדאיות התא 3,4. באופן מעניין, CNA/B נמצא בשפע במוח היונקים, ומבחין בין שני איזופורמים של תת-היחידה A של CN: α ו-β.
תחת לחץ מתמשך בחדר המיון, מסלול האיתות PERK הוא ענף ה-UPR היחיד שנותר פעיל, ובכך מתווך הן את התגובה הפרו-הישרדותית והן את התגובה האפופטוטית. בשלב הכרוני, אירוע מרכזי אחד במורד הזרם הוא השראת גורם השעתוק, CHOP (CCAAT/enhancer binding protein homologous protein)5. לחץ כרוני בחדר מיון מוכר יותר ויותר כתורם נפוץ למגוון רחב של הפרעות פתולוגיות, כולל מחלות נוירודגנרטיביות6. חשוב להבין כיצד UPR יכול להקל על איתות cytoprotective במקום מוות תאי 7. עם זאת, כיום מעט ידוע על המנגנון המדויק השולט במעבר בין שני שלבי UPR אלה.
לאחרונה מצאנו כי בתאי עצב בתרבית, גנגליוזיד GM2 מצטבר בקרומי המיון וגורם לדלדול הסידן הלומינלי. זה בתורו מפעיל איתות PERK, אשר מתווך ניוון עצבי אפופטוזיס 8. במחקר זה, הצטברות GM2 בתאי עצב בתרבית משמשת כמודל של מערכת התא של ניוון נוירוטים הנגרם על ידי לחץ ER. באופן ספציפי, שני ביטויי גורם PERK הם מניפולציה, CN-Aα ו CHOP, אשר מחליף את המעבר בין אירועים מוקדמים / מגן לשלב כרוני / אפופטוטי. כדי להשיג זאת, הגנים המתאימים מושתקים; לפיכך, תרביות נוירונים ראשוניים בקליפת המוח נגועים ב-shRNA ספציפי המועבר על ידי לנטיוירוס. ניתוח כתמים מערביים מגלה ירידה משמעותית ברמות הביטוי של CN-Aα ו- CHOP בהשוואה לתאי הביקורת, הנגועים בלנטיוירוס הנושאים shRNA מקושקש. לאחר טיפול זה, נוירונים נתונים לזמני דגירה שונים של GM2 אקסוגני, קבוע, ומוכתמים חיסוניתעם נוגדן 2 הקשור לחלבון 2 (MAP2) 9. התמונות מתקבלות באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. הגידול הכולל של תאי עצב מוערך ביחס למספר התאים הכולל.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מתארים מערכת ניסויית המאפשרת אפנון מולקולרי של המעבר משלב הישרדות לשלב UPR אפופטוטי במודל תאי עצב.
לצורך ניתוח נכון של ניוון עצבים, חיוני להשיג תרביות נוירונים ראשוניות עם תהליכים רבים, ארוכים ומסועפים מאוד 9,11. זה מקל על בחינת הארכת תהליך ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר גונזלו קוואסולו על עזרתו שלא תסולא בפז בהדמיה ולד”ר אנדראה פלגריני על התמיכה הטכנית בתרביות תאים.
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מ: המכון הלאומי לבריאות, ארה”ב (#RO1AG058778-01A1, Subaward Agreement No 165148/165147 בין UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra) ומהסוכנות הלאומית של Agencia Nacional de Scientific and Technological Promotion, Argentina (ANPCyT, PICT 2017 #0618).
Materials
| Alexa Fluor 488 anti-Mouse | Thermo Fisher Scientific | #R37120 | |
| anti-CHOP | Thermo Fisher | # MA1 – 250 | |
| Anti-CN-Aα | Millipore | # 07-067 | |
| Anti-GM2 | Matreya | #1961 | |
| anti-MAP2 | Sigma Aldrich | # M2320 | |
| anti-β-actin | Thermo Fisher | # PA1 – 183 | |
| aprotinin | Santa Cruz Biotechnology | #3595 | |
| Axiovert 200 epifluorescence microscope | Zeiss | ||
| B27 supplement | Life Technologies | #17504944 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | #11966025 | |
| EcoRI | Promega | #R6011 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Life Technologies | #16000044 | |
| Fine-tippeds forceps style #5 | Dumont | ||
| Forcep style #3 | Dumont | ||
| HEK 293 | ATCC | #CRL-1573 | |
| IRDye 680 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632221 | |
| IRDye 680 secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632220 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632210 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632211 | |
| lentiviral envelope plasmid pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| lentiviral packing plasmid psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| lentiviral vector pLKO.3G | Addgene | #14748 | |
| Leupeptin hemisulfate | Santa Cruz Biotechnology | #295358 | |
| Lipofectamine LTX & Plus Reagent (plasmid transfection reagent) | Life Technologies | #A12621 | |
| MISSION shRNA | Sigma Aldrich | ||
| Monosialoganglioside GM2 | Matreya | #1502 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Neurobasal Medium | Life Technologies | #21103049 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | BIO-RAD | #1620115 | |
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Bioscience | ||
| OneShot Top 10 | Life Technology | #C404010 | |
| Opti-MEM (Reduced serum media) | Life Technologies | #105802 | |
| PacI | BioLabs | #R0547S | |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | #15140122 | |
| Pepstatin A | Santa Cruz Biotechnology | #45036 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Santa Cruz Biotechnology | #329-98-6 | |
| Poly-L-lysine | sigma aldrich | P#2636 | |
| Straight sharp small spring scissors | Fine Science Tools | ||
| T4 DNA Ligase | Promega | #M1801 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | Life Technologies | #25200056 | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processor (VCX 130) | Sonics | ||
| Wizard plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | #A1330 |
References
- Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annual Review of Biochemistry. 74, 739-789 (2005).
- Cui, W., Li, J., Ron, D., Sha, B. The structure of the PERK kinase domain suggests the mechanism for its activation. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, 423-428 (2011).
- Bollo, M., et al. Calcineurin interacts with PERK and dephosphorylates calnexin to relieve ER stress in mammals and frogs. PLoS One. 5, 11925 (2010).
- Chen, Y., Holstein, D. M., Aime, S., Bollo, M., Lechleiter, J. D. Calcineurin beta protects brain after injury by activating the unfolded protein response. Neurobiology of Disease. 94, 139-156 (2016).
- Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Molecular Cell. 11, 619-633 (2003).
- Hetz, C., Saxena, S. ER stress and the unfolded protein response in neurodegeneration. Nature Reviews Neurology. 13, 477-491 (2017).
- Lin, J. H., Li, H., Zhang, Y., Ron, D., Walter, P. Divergent effects of PERK and IRE1 signaling on cell viability. PLoS One. 4, 4170 (2009).
- Virgolini, M. J., Feliziani, C., Cambiasso, M. J., Lopez, P. H., Bollo, M. Neurite atrophy and apoptosis mediated by PERK signaling after accumulation of GM2-ganglioside. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1866, 225-239 (2019).
- Ferreira, A., Busciglio, J., Landa, C., Caceres, A. Ganglioside-enhanced neurite growth: evidence for a selective induction of high-molecular-weight MAP-2. The Journal of Neuroscience. 10, 293-302 (1990).
- Moore, C. B., Guthrie, E. H., Huang, M. T., Taxman, D. J. Short hairpin RNA (shRNA): design, delivery, and assessment of gene knockdown. Methods in Molecular Biology. 629, 141-158 (2010).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).
- Rusnak, F., Mertz, P. Calcineurin: form and function. Physiological Reviews. 80, 1483-1521 (2000).
- Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes & Development. 17, 2205-2232 (2003).
- Endo, M., Mori, M., Akira, S., Gotoh, T. C/EBP homologous protein (CHOP) is crucial for the induction of caspase-11 and the pathogenesis of lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 176, 6245-6253 (2006).
