Modulazione molecolare da parte di shRNA specifici forniti da lentivirus in neuroni stressati dal reticolo endoplasmatico
Summary
Nel presente studio, l’espressione viene abbattuta di due componenti di segnalazione a valle della via PERK, la calcineurina citoprotettiva e la CHOP pro-apoptotica, utilizzando specifici shRNA. In modi opposti, questi modulano la suscettibilità dei neuroni corticali primari all’atrofia dei neuriti dopo l’induzione dello stress del reticolo endoplasmatico.
Abstract
L’accumulo di proteine unfolded all’interno del reticolo endoplasmatico (ER), causato da qualsiasi condizione di stress, innesca la risposta proteica unfolded (UPR) attraverso l’attivazione di sensori specializzati. UPR tenta prima di ripristinare l’omeostasi; Ma se il danno persiste la segnalazione induce apoptosi.
Vi è una crescente evidenza che lo stress ER prolungato e irrisolto contribuisce a molte condizioni patologiche, comprese le malattie neurodegenerative. Poiché l’UPR controlla il destino cellulare passando da processi citoprotettivi a processi apoptotici, è essenziale comprendere gli eventi che definiscono questa transizione, nonché gli elementi coinvolti nella sua modulazione.
Recentemente, abbiamo dimostrato che l’accumulo anomalo di ganglioside GM2 causa l’esaurimento del contenuto di ER Ca2+ , che a sua volta attiva PERK (PKR-like-ER chinasi), uno dei sensori UPR. Inoltre, la segnalazione PERK partecipa all’atrofia dei neuriti e all’apoptosi indotta dall’accumulo di GM2. A questo proposito, abbiamo stabilito un sistema sperimentale che ci consente di modulare molecolarmente l’espressione dei componenti PERK a valle e quindi modificare la vulnerabilità dei neuroni a subire atrofia neuritica.
Abbiamo eseguito knockdown dell’espressione di calcineurina (citoprotettiva) e CHOP (pro-apoptotica) in colture neuronali corticali di ratto. Le cellule sono state infettate con shRNA specifico consegnato da lentivirus e poi trattate con GM2 in tempi diversi, fissate e immunocolorate con anticorpi anti-MAP2 (proteina 2 associata al microtubo). Successivamente, le immagini cellulari sono state registrate utilizzando un microscopio a fluorescenza e la crescita totale dei neuriti è stata valutata utilizzando il software di elaborazione delle immagini di dominio pubblico ImageJ. L’inibizione dell’espressione di tali componenti di segnalazione PERK ha chiaramente permesso di accelerare o ritardare l’atrofia neuritica indotta dallo stress ER.
Questo approccio potrebbe essere utilizzato in modelli di sistemi cellulari di stress ER per valutare la vulnerabilità dei neuroni all’atrofia dei neuriti.
Introduction
Lo stress del reticolo endoplasmatico (ER) è definito come qualsiasi perturbazione che compromette la capacità di ripiegamento delle proteine nell’organello. L’accumulo di proteine non ripiegate all’interno del lume ER attiva un segnale a cascata di trasduzione chiamato risposta proteica ripiegata (UPR). Questa complessa via di segnalazione è orchestrata da tre sensori di stress: PERK (protein chinasi RNA [PKR]-like ER kinase), IRE1 (enzima 1 che richiede inositolo) e ATF6 (fattore di trascrizione attivato 6). Tutti insieme tentano di ripristinare l’omeostasi. Ma se lo stress persiste, l’UPR alla fine induce la morte cellulare per apoptosi1.
PERK, una proteina transmembrana ER, dopo stress ER, guida la fosforilazione del fattore di iniziazione eucariotica-2 alfa (eIF2α), riducendo la sintesi proteica globale e quindi il carico proteico nell’ER2. Abbiamo dimostrato che la calcineurina A/B (CNA/B), una fosfatasi Ca 2+ eterodimera, lega direttamente il dominio citosolico della PERK, aumentandone l’autofosforilazione e migliorando significativamente l’inibizione della traduzione proteica e della vitalità cellulare 3,4. È interessante notare che CNA / B è abbondante nel cervello dei mammiferi, distinguendo due isoforme della subunità A di CN: α e β.
Sotto stress ER prolungato, la via di segnalazione PERK è l’unica branca UPR che rimane attivata, mediando così sia la risposta pro-sopravvivenza che quella apoptotica. Nella fase cronica, un importante evento a valle è l’induzione del fattore di trascrizione, CHOP (CCAAT/enhancer binding protein homologous protein)5. Lo stress cronico del pronto soccorso è anche sempre più riconosciuto come un contributo comune a una vasta gamma di disturbi patologici, comprese le malattie neurodegenerative6. È importante capire come l’UPR può facilitare la segnalazione citoprotettiva invece della morte cellulare 7. Tuttavia, al momento si sa poco sull’esatto meccanismo che controlla la transizione tra queste due fasi UPR.
Recentemente, abbiamo scoperto che, nei neuroni in coltura, il ganglioside GM2 si accumula nelle membrane ER e induce l’esaurimento del calcio luminale. Questo a sua volta attiva la segnalazione PERK, che media l’atrofia dei neuriti e l’apoptosi 8. In questo studio, l’accumulo di GM2 nei neuroni in coltura viene utilizzato come modello di sistema cellulare dell’atrofia neurite indotta dallo stress ER. In particolare, vengono manipolate due espressioni del fattore PERK, CN-Aα e CHOP, che commuta la transizione tra eventi precoci / protettivi e una fase cronica / apoptotica. Per raggiungere questo obiettivo, i rispettivi geni vengono silenziati; pertanto, le colture primarie di neuroni corticali sono infettate da shRNA specifico consegnato da lentivirus. L’analisi Western blot rivela una significativa riduzione dei livelli di espressione di CN-Aα e CHOP rispetto alle cellule di controllo, che sono infettate da lentivirus che trasportano uno shRNA criptato. Dopo questo trattamento, i neuroni sono sottoposti a diversi tempi di incubazione di GM2 esogeno, fissi e immunocolorati con anticorpo 2 (MAP2) anti-microtubulo associato alla proteina 2 (MAP2)9. Le immagini sono ottenute con un microscopio a epifluorescenza. La crescita totale dei neuriti viene valutata rispetto al numero totale di cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descriviamo un sistema sperimentale che consente la modulazione molecolare della transizione dalla sopravvivenza alle fasi UPR apoptotica in un modello di cellula neuronale.
Per una corretta analisi dell’atrofia dei neuriti, è essenziale ottenere colture neuronali primarie con numerosi, lunghi, processi altamente ramificati 9,11. Ciò facilita l’esame dell’estensione del processo neuronale, consentendo di rilevare le chiare differenze…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Gonzalo Quasollo per il suo prezioso aiuto con l’imaging e il Dr. Andrea Pellegrini per il supporto tecnico della coltura cellulare.
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni di: National Institute of Health, USA (#RO1AG058778-01A1, Subaward Agreement No 165148/165147 tra UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra) e dall’Agenzia Nazionale dell’Agencia Nacional de Scientific and Technological Promotion, Argentina (ANPCyT, PICT 2017 #0618).
Materials
| Alexa Fluor 488 anti-Mouse | Thermo Fisher Scientific | #R37120 | |
| anti-CHOP | Thermo Fisher | # MA1 – 250 | |
| Anti-CN-Aα | Millipore | # 07-067 | |
| Anti-GM2 | Matreya | #1961 | |
| anti-MAP2 | Sigma Aldrich | # M2320 | |
| anti-β-actin | Thermo Fisher | # PA1 – 183 | |
| aprotinin | Santa Cruz Biotechnology | #3595 | |
| Axiovert 200 epifluorescence microscope | Zeiss | ||
| B27 supplement | Life Technologies | #17504944 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | #11966025 | |
| EcoRI | Promega | #R6011 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Life Technologies | #16000044 | |
| Fine-tippeds forceps style #5 | Dumont | ||
| Forcep style #3 | Dumont | ||
| HEK 293 | ATCC | #CRL-1573 | |
| IRDye 680 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632221 | |
| IRDye 680 secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632220 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632210 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632211 | |
| lentiviral envelope plasmid pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| lentiviral packing plasmid psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| lentiviral vector pLKO.3G | Addgene | #14748 | |
| Leupeptin hemisulfate | Santa Cruz Biotechnology | #295358 | |
| Lipofectamine LTX & Plus Reagent (plasmid transfection reagent) | Life Technologies | #A12621 | |
| MISSION shRNA | Sigma Aldrich | ||
| Monosialoganglioside GM2 | Matreya | #1502 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Neurobasal Medium | Life Technologies | #21103049 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | BIO-RAD | #1620115 | |
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Bioscience | ||
| OneShot Top 10 | Life Technology | #C404010 | |
| Opti-MEM (Reduced serum media) | Life Technologies | #105802 | |
| PacI | BioLabs | #R0547S | |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | #15140122 | |
| Pepstatin A | Santa Cruz Biotechnology | #45036 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Santa Cruz Biotechnology | #329-98-6 | |
| Poly-L-lysine | sigma aldrich | P#2636 | |
| Straight sharp small spring scissors | Fine Science Tools | ||
| T4 DNA Ligase | Promega | #M1801 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | Life Technologies | #25200056 | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processor (VCX 130) | Sonics | ||
| Wizard plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | #A1330 |
References
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