小胞体ストレスニューロンにおけるレンチウイルス送達特異的shRNAによる分子調節
Summary
本研究では、特定のshRNAを使用して、PERK経路の2つの下流シグナル伝達成分である細胞保護カルシニューリンとアポトーシス促進型CHOPの発現をノックダウンします。反対に、これらは小胞体ストレスの誘導後の神経突起萎縮に対する初代皮質ニューロンの感受性を調節する。
Abstract
ストレス状態によって引き起こされる小胞体(ER)内の折り畳まれていないタンパク質の蓄積は、特殊なセンサーの活性化を介して折り畳まれていないタンパク質応答(UPR)を引き起こします。UPRは最初に恒常性を回復しようとします。しかし、損傷が持続する場合、シグナル伝達はアポトーシスを誘導します。
持続的および未解決の小胞体ストレスが神経変性疾患を含む多くの病理学的状態に寄与するという証拠が増えています。UPRは細胞保護プロセスとアポトーシスプロセスを切り替えることによって細胞の運命を制御するため、この遷移を定義するイベントとその調節に関与する要素を理解することが不可欠です。
最近、GM2ガングリオシドの異常な蓄積がERCa2+ 含量の枯渇を引き起こし、それがUPRセンサーの1つであるPERK(PKR様ERキナーゼ)を活性化することを実証しました。さらに、PERKシグナル伝達は、GM2蓄積によって誘導される神経突起萎縮およびアポトーシスに関与する。この点、下流のPERK成分の発現を分子的に調節し、神経突起萎縮を起こす神経細胞の脆弱性を変化させる実験系を確立しました。
ラット皮質神経細胞培養におけるカルシニューリン(細胞保護)およびCHOP(アポトーシス促進)発現のノックダウンを行った。細胞をレンチウイルス送達特異的shRNAに感染させ、次いで異なる時間にGM2で処理し、固定し、抗MAP2(マイクロチューブ関連タンパク質2)抗体で免疫染色した。その後、蛍光顕微鏡を用いて細胞画像を記録し、パブリックドメインの画像処理ソフトウェアImageJを用いて全神経突起伸長を評価した。これらのPERKシグナル伝達成分の発現の阻害は、ERストレスによって誘発される神経突起性萎縮を加速または遅延させることを明らかに可能にした。
このアプローチは、ERストレスの細胞系モデルで、神経突起萎縮に対するニューロンの脆弱性を評価するために使用される可能性があります。
Introduction
小胞体(ER)ストレスは、細胞小器官のタンパク質折り畳み能力を損なう摂動として定義されます。小胞体内腔内の折り畳まれていないタンパク質の蓄積は、折り畳まれていないタンパク質応答(UPR)と呼ばれる形質導入カスケードシグナルを活性化します。この複雑なシグナル伝達経路は、PERK(プロテインキナーゼRNA[PKR]様ERキナーゼ)、IRE1(イノシトールを必要とする酵素1)、およびATF6(活性化転写因子6)の3つのストレスセンサーによって調整されています。全員が一緒に恒常性を回復しようとします。しかし、ストレスが続くと、UPRは最終的にアポトーシスによって細胞死を誘導します1。
小胞体膜貫通タンパク質であるPERKは、小胞体ストレス時に真核生物開始因子-2アルファ(eIF2α)のリン酸化を導き、全体的なタンパク質合成、ひいては小胞体2におけるタンパク質負荷を減少させる。我々は、ヘテロ二量体Ca2+ホスファターゼであるカルシニューリンA/B(CNA/B)がPERKの細胞質ドメインに直接結合し、その自己リン酸化を増加させ、タンパク質翻訳と細胞生存率の阻害を有意に増強することを実証しました3,4。興味深いことに、CNA/Bは哺乳類の脳に豊富にあり、CNのサブユニットAの2つのアイソフォーム、αとβを区別しています。
持続的なERストレス下では、PERKシグナル伝達経路は活性化されたままの唯一のUPR分岐であり、したがって生存促進応答とアポトーシス応答の両方を媒介します。慢性期における下流の主要な事象の1つは、転写因子であるCHOP(CCAAT/エンハンサー結合タンパク質相同タンパク質)の誘導です5。慢性小胞体ストレスはまた、神経変性疾患を含む広範な病理学的障害への共通の寄与物としてますます認識されています6。UPRが細胞死の代わりに細胞保護シグナル伝達をどのように促進できるかを理解することが重要です 7。しかし、現在のところ、これら2つのUPR相間の遷移を制御する正確なメカニズムについてはほとんど知られていません。
最近、培養ニューロンにおいて、ガングリオシドGM2が小胞体膜に蓄積し、管腔カルシウム枯渇を誘導することを見出しました。これにより、神経突起萎縮とアポトーシスを媒介するPERKシグナル伝達が活性化されます 8。本研究では、培養ニューロンにおけるGM2の蓄積を、小胞体ストレス誘発性神経突起萎縮症の細胞系モデルとして用いる。具体的には、CN-AαとCHOPの2つのPERK因子発現が操作され、初期/保護イベントと慢性/アポトーシス段階の間の遷移が切り替わります。これを達成するために、それぞれの遺伝子は沈黙しています。したがって、初代皮質ニューロン培養物は、レンチウイルス送達された特異的shRNAに感染している。ウェスタンブロット解析では、スクランブルshRNAを保有するレンチウイルスに感染した対照細胞と比較して、CN-AαおよびCHOP発現レベルが大幅に低下することが明らかになりました。この処理の後、ニューロンは、外因性GM2の異なるインキュベーション時間に供され、固定され、抗微小管関連タンパク質2(MAP2)抗体9で免疫染色される。画像は落射蛍光顕微鏡で取得されます。全神経突起伸長は、総細胞数に対して評価される。
Protocol
Representative Results
Discussion
神経細胞モデルにおける生存期からアポトーシスUPR期への移行の分子調節を可能にする実験系について述べる。
神経突起萎縮の適切な分析のためには、多数の長く高度に分岐したプロセスを有する初代ニューロン培養物を得ることが不可欠である9,11。これにより、ニューロン突起の伸長の検査が容易になり、処理間の明確な?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
イメージングに関する貴重な支援を提供してくれたゴンザロ・クアソロ博士と、細胞培養技術サポートを提供してくれたアンドレア・ペレグリーニ博士に感謝します。
この研究は、米国国立衛生研究所(#RO1AG058778-01A1、UTHSCSA-Instituto Instituto Investigación Médica M M Ferreyra間のサブアワード契約No 165148/165147)およびアルゼンチン国立科学技術振興庁(ANPCyT、PICT 2017 #0618)からの助成金によって支援されました。
Materials
| Alexa Fluor 488 anti-Mouse | Thermo Fisher Scientific | #R37120 | |
| anti-CHOP | Thermo Fisher | # MA1 – 250 | |
| Anti-CN-Aα | Millipore | # 07-067 | |
| Anti-GM2 | Matreya | #1961 | |
| anti-MAP2 | Sigma Aldrich | # M2320 | |
| anti-β-actin | Thermo Fisher | # PA1 – 183 | |
| aprotinin | Santa Cruz Biotechnology | #3595 | |
| Axiovert 200 epifluorescence microscope | Zeiss | ||
| B27 supplement | Life Technologies | #17504944 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | #11966025 | |
| EcoRI | Promega | #R6011 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Life Technologies | #16000044 | |
| Fine-tippeds forceps style #5 | Dumont | ||
| Forcep style #3 | Dumont | ||
| HEK 293 | ATCC | #CRL-1573 | |
| IRDye 680 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632221 | |
| IRDye 680 secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632220 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632210 | |
| IRDye 800 CW secondary antibody | LI-COR Biosciences | #92632211 | |
| lentiviral envelope plasmid pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| lentiviral packing plasmid psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| lentiviral vector pLKO.3G | Addgene | #14748 | |
| Leupeptin hemisulfate | Santa Cruz Biotechnology | #295358 | |
| Lipofectamine LTX & Plus Reagent (plasmid transfection reagent) | Life Technologies | #A12621 | |
| MISSION shRNA | Sigma Aldrich | ||
| Monosialoganglioside GM2 | Matreya | #1502 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Neurobasal Medium | Life Technologies | #21103049 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | BIO-RAD | #1620115 | |
| Odyssey infrared imaging system | LI-COR Bioscience | ||
| OneShot Top 10 | Life Technology | #C404010 | |
| Opti-MEM (Reduced serum media) | Life Technologies | #105802 | |
| PacI | BioLabs | #R0547S | |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | #15140122 | |
| Pepstatin A | Santa Cruz Biotechnology | #45036 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Santa Cruz Biotechnology | #329-98-6 | |
| Poly-L-lysine | sigma aldrich | P#2636 | |
| Straight sharp small spring scissors | Fine Science Tools | ||
| T4 DNA Ligase | Promega | #M1801 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 % | Life Technologies | #25200056 | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processor (VCX 130) | Sonics | ||
| Wizard plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | #A1330 |
References
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