Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

توليد وتجميع النوى الخاصة بالفيروسات من الفيروسات المتزامنة التنفسية

Published: July 27, 2021 doi: 10.3791/62010
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry, Emory University School of Medicine

Summary

للتحليل الميكانيكي المتعمق للفيروس التزامني التنفسي (RSV) تخليق الحمض النووي الريبي ، نبلغ عن بروتوكول لاستخدام فوسفوبروتين الفوسفورتين المرافق (P) للكوادر الخالية من الحمض النووي الريبي (N0)للتجميع المختبري اللاحق للنيوكليوكابسيدات الخاصة بالفيروس (NCs).

Abstract

استخدام قالب الحمض النووي الريبي أصيلة أمر بالغ الأهمية لتعزيز المعرفة الأساسية لتوليف الحمض النووي الريبي الفيروسية التي يمكن أن توجه كل من اكتشاف ميكانيكي وتطوير المقايسة في علم الفيروسات. إن نموذج الحمض النووي الريبي لفيروسات الحمض النووي الريبي غير المخلوقة (NNS) من فيروسات الحمض النووي الريبي (NNS)، مثل فيروس التزامن التنفسي (RSV)، ليس جزيء الحمض النووي الريبي وحده، بل هو مركب الريبونوكليوبروتين (N) المنقوع. على الرغم من أهمية قالب الحمض النووي الريبي الأصيل ، فإن توليد وتجميع مثل هذا المجمع ريبونوكليوبوبروتين لا تزال متطورة وتتطلب توضيحا متعمقا. التحدي الرئيسي هو أن RSV N مفرط التعبير يربط بشكل غير محدد بالرنانات الخلوية لتشكيل جزيئات عشوائية تشبه النيوكليوكابسيد (NCLPs). هنا، أنشأنا بروتوكولا للحصول على N خالية من الحمض النووي الريبي (N0)أولا من خلال المشاركة في التعبير N مع فوسفوبروتين مرافق (P)، ثم تجميع N0 مع أوليغوس الحمض النووي الريبي مع تسلسل الحمض النووي الريبي RSV محددة للحصول على نواة خاصة بالفيروسات (NCs). يوضح هذا البروتوكول كيفية التغلب على صعوبة في إعداد هذا المعقد ribonucleoprotein الفيروسية الصعبة تقليديا.

Introduction

غير الفئات السلبية الشعور (NNS) فيروسات الحمض النووي الريبي تشمل العديد من مسببات الأمراض البشرية الهامة، مثل داء الكلب، والإيبولا، وفيروس التزامن التنفسي (RSV)1،2. RSV هو السبب الرئيسي لأمراض الجهاز التنفسي مثل التهاب القصيبات والالتهاب الرئوي في الأطفال الصغار وكبار السن في جميع أنحاء العالم3. حاليا، لا توجد لقاحات فعالة أو علاجات مضادة للفيروسات المتاحة لمنع أو علاج RSV4. كجزء من دورة الحياة، يعمل جينوم RSV كنموذج للنسخ المتماثل من قبل بوليمرات الحمض النووي الريبي التابع ل RSV لإنتاج مستضد، والذي بدوره يعمل كنموذج لتوليد جينوم ذري. يتم كذلك تحلل كل من الجينوم والرنانات المضادة للجينوم بالكامل بواسطة النوى (N) لتشكيل النيوكليوكابسيدات (NCs)3. لأن NCs بمثابة قوالب لكل من النسخ المتماثل والنسخ من قبل بوليمراز RSV، التجمع NC السليم أمر بالغ الأهمية للبوليميراز للوصول إلى قوالب لتخليق الحمض النووي الريبي5. ومن المثير للاهتمام، استنادا إلى التحليلات الهيكلية للبوليميرا الفيروسية NNS، فمن المفترض أن العديد من البروتينات N ينفصم عابرا من NCs للسماح بالوصول إلى البوليميراز وإعادة ربط إلى الجيش الملكي النيبالي بعد تخليق الحمض النووي الريبي6،7،8،9،10،12.

حاليا، وقد أنشئت RSV الحمض النووي الريبي البلمرة المقايسة باستخدام البوليمرات RSV تنقية على قوالب الجيش الملكي النيبالي عارية قصيرة13،14. ومع ذلك، فإن أنشطة البوليميراز RSV لا تصل إلى المستوى الأمثل، كما لوحظ في المنتجات غير المعالجة والإجهاضية التي تولدها بوليمرات RSV عند استخدام قوالب الحمض النووي الريبي العارية. عدم وجود NC مع الحمض النووي الريبي فيروس محددة هو الحاجز الرئيسي لمزيد من الفهم الآلي لتوليف الحمض النووي الريبي RSV. ولذلك، باستخدام قالب الحمض النووي الريبي أصيلة يصبح حاجة ماسة لتعزيز المعرفة الأساسية من تخليق الحمض النووي الريبي RSV. الهياكل المعروفة للجسيمات الشبيهة بالنيوكليوكابسيد (NCLPs) من RSV وغيرها من فيروسات الحمض النووي الريبي NNS تكشف عن أن الحمض النووي الريبي في NCLPs هي إما الحمض النووي الريبي الخلوي العشوائي أو متوسط الحمض النووي الريبي الجينومي الفيروسي15،16،17،18،19. معا، العقبة الرئيسية هي أن N يربط بشكل غير محدد إلى RNAs الخلوية لتشكيل NCLPs عندما يتم التعبير عن N في الخلايا المضيفة.

للتغلب على هذه العقبة، أنشأنا بروتوكولا للحصول على RNA خالية (N0)أولا وتجميع N0 مع الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسية الأصيلة في NCLPs20. مبدأ هذا البروتوكول هو الحصول على كمية كبيرة من N RNA خالية من المؤتلف (N0)من خلال التعبير المشترك N مع مرافق, المجال N-محطة من فوسفوبروتين RSV (PNTD). يمكن تحفيز N0P المنقى وتجميعه في NCLPs عن طريق إضافة أوليغوس الحمض النووي الريبي الخاص ب RSV ، وخلال عملية التجميع ، يتم إزاحة المرافق PNTD عند إضافة أوليغوس الحمض النووي الريبي.

هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول لتوليد وتجميع NCs RSV RNA محددة. في هذا البروتوكول، نقوم بوصف الاستنساخ الجزيئي، وإعداد البروتين، والتجميع في المختبر، والتحقق من صحة التجميع المعقد. ونسلط الضوء على استراتيجية الاستنساخ لتوليد بنى ثنائية السيسترونيك للكراز المشترك للبروتين للاستنساخ الجزيئي. لإعداد البروتين، ونحن نصف إجراءات زراعة الخلايا، واستخراج البروتين، وتنقية مجمع البروتين. ثم نناقش طريقة التجميع في المختبر من NCs RSV RNA محددة. وأخيرا، نستخدم كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) والمجهر الإلكتروني السلبي للبقع (EM) لتوصيف وتصور NCLPs المجمعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الاستنساخ الجزيئي

ملاحظة: تم استخدام ليجاس الاستنساخ المستقل (LIC) لجعل RSV ثنائي cistronic coexpression بناء البلازميد. LIC هو أسلوب وضعت في أوائل 1990s، والذي يستخدم النشاط إكسو 3'-5 'من بوليمرات الحمض النووي T4 لخلق يتدلى مع التكامل بين ناقلات وإدراج الحمض النووي21،22. تم إجراء البنى باستخدام الحمض النووي الناقل 2BT-10 ، والذي يتكون من علامة 10x في N-terminal من إطار القراءة المفتوحة (ORF) (الشكل 1).

  1. تنفيذ linearization من ناقلات LIC باستخدام الهضم SSPI.
    1. الجمع بين 10 ميكرولتر من العازلة SSPI 10X، 4 ميكرولتر من إنزيم SSPI بتركيز 5 U/μL، وحجم يعادل 5 ميكروغرام من الحمض النووي مينيبريب ناقلات، وddHعقيمة 2O إلى 100 ميكرولتر.
    2. احتضان هضم لمدة 3 ساعات في 37 درجة مئوية.
    3. تشغيل هضم على هلام agarose 1.0٪ لاستخراج الحمض النووي ناقلات.
    4. استخدام مجموعة استخراج هلام لأداء استخراج وتنقية. تعليق الحجم النهائي للحمض النووي المتجه في 30 ميكرولتر من ddH2O وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
  2. إعداد إدراج الحمض النووي لN1-391 وP1-126 باستخدام التمهيدي N1-391 إلى الأمام، N1-391 التمهيدي العكسي، P1-126 التمهيدي إلى الأمام، وP1-126 التمهيدي العكسي(الجدول 1).
    ملاحظة: هناك تداخل كاف مع المتجه الخطي لضمان درجة حرارة ذوبان تتراوح بين 55 درجة مئوية و 60 درجة مئوية. بالنسبة لللتمهيد العكسي، هناك تداخل كاف مع الخيط التكميلي العكسي للمتجه الخطي لنفس السبب.
    1. إجراء تضخيم PCR لإدراج الحمض النووي باستخدام الشروط في الجدول 2 والجدول 3.
    2. استخراج إدراج الحمض النووي تضخيمها. تشغيل منتجات PCR من الخطوة السابقة على هلام agarose 1.0٪، ثم استخراج وتنقية العصابات عن طريق استخراج هلام. تعليق الحجم النهائي للحمض النووي المستخرج في 15 ميكرولتر من ddH2O.
  3. T4 معالجة بوليمرات الحمض النووي من ناقلات وإدراج الحمض النووي (الجدول 4).
    ملاحظة: يجب إجراء العلاج بشكل منفصل للحمض النووي الناقل وإدراج الحمض النووي.
    1. احتضان الخليط لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم، الحرارة تعطيل البوليميراز في 75 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تخزين خليط التفاعل في -20 درجة مئوية.
  4. أنال متجه LIC و متجه الإدراج.
    1. إعداد التحكم السلبي مع 2 ميكرولتر من الحمض النووي ناقلات LIC و 2 ميكرولتر من ddH2O العقيمة.
    2. الجمع بين 2 ميكرولتر من إدراج الحمض النووي و 2 ميكرولتر من الحمض النووي ناقلات LIC من تفاعلات بوليمرات الحمض النووي T4 السابقة في أنبوب 0.2 مل.
    3. قم بإجراء رد فعل التلهين في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    4. إخماد رد الفعل مع 1.3 ميكرولتر من EDTA بتركيز 25 mM.
    5. تحويل رد الفعل إلى 100 ميكرولتر من E. coli Top10 الخلايا المختصة ولوح لهم على لوحة اختيار أمبيسلين23،24.
  5. تحديد البنى الإيجابية.
    1. إعداد محلول البلازميد miniprep. ويمكن القيام بذلك من خلال التقاط مستعمرة والتلقيح في وسائل الإعلام LB. عادة، 3 مستعمرات كافية.
    2. احتضان الخليط بين عشية وضحاها في 37 °C.
    3. طارد مركزي الخليط في 4560 × ز لمدة 10 دقائق والتخلص من supernatant.
    4. Resuspend الكريات في 250 ميكرولتر من العازلة P1 وإعداد الهياكل المصغرة البلازميد باستخدام مجموعة miniprep تدور.
    5. إجراء تحليل الهضم للمنتج miniprep باستخدام AseI أو غيرها من الإنزيمات تقييد.
    6. تحميل العينات على هلام agarose 0.8٪ وتشغيل البلازميد المهضوم. تحليل هلام تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية.
    7. استخدم خدمة تسلسل للتحقق من تسلسل المنتج الموجب.
  6. الحصول على إدراج الحمض النووي coexpression.
    1. تنفيذ PCR للحصول على N1-391 وP1-126 باستخدام 2BT-10 N1-391 و 2BT-10 P1-126 قوالب.
    2. تنفيذ 1ST PCR للحصول على N1-391 من بناء 2BT-10 N1-391 باستخدام شروط PCR في الجدول 2 والجدول 3 مع التمهيدي N1-391 إلى الأمام وعكس التمهيدي 5 '-GTGAAGACTCTCTGGCAATGCGGCG
      CGGCGGATCGCGGATCC-3
    3. تنفيذ 2ND PCR للحصول على P1-126 من بناء 2BT-10 P1-126 باستخدام التمهيدي الأمامي: 5'-CCGCCGCATTGCATCAGGGGATCTCTACTGC
      AGGACTCGAGTTCTAGA-3 وP1-126 التمهيدي العكسي (استخدام شروط PCR في الجدول 2 والجدول 3).
    4. وأخيرا، أداء تداخل PCR على المنتجات المختلطة من ردود الفعل PCR 2 السابقة لدمج N1-391 وP1-126. استخدام التمهيدي N1-391 إلى الأمام وP1-126 التمهيدي العكسي. استخدم شروط PCR في الجدول 5 والجدول 6.
  7. انضم إلى المتجه وإدراج الحمض النووي.
    1. علاج تداخل PCR المنتج مع T4 الحمض النووي بوليمرات بعد البروتوكول في الخطوة 1.3.
    2. آنال متجه LIC ومنتج PCR باتباع البروتوكول في الخطوة 1.4.
    3. تحديد بنيات موجبة التالية البروتوكول في الخطوة 1.5.

2. التعبير عن البروتين وتنقية

ملاحظة: استخدام الإشريكية القولونية لبناء ثنائي cistronic من coexpression من كل من N و P. الثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية، ولكن تنفيذ التعبير في درجة حرارة منخفضة (16 درجة مئوية) بين عشية وضحاها. تنقية مجمعات البروتين من خلال مزيج من عمود الكوبالت، وتبادل الأيونات، وحجم اللونية استبعاد (الشكل 2).

  1. استخدم سلالة E. coli BL21 (DE3) لإنتاج البروتين. تنمو 4 لتر ثقافات الخلية في 37 درجة مئوية في LB (لوريا مرق) المتوسطة حتى OD600 تصل إلى 0.6.
  2. خفض درجة الحرارة إلى 16 درجة مئوية. بعد ساعة، حث التعبير مع 0.5 mM ايزوبروبيل 1-ثيو - D-galactopyranoside (IPTG) بين عشية وضحاها.
  3. الطرد المركزي الخلايا في 4104 × ز لمدة 25 دقيقة ومن ثم التخلص من supernatant.
  4. Resuspend الكريات الخلية في 200 مل من تحلل العازلة A (50 م فوسفات الصوديوم, pH 7.4, 500 mM NaCl, 5 mM imidazole, 10٪ الجلسرين, و 0.2٪ NP40). استخدام 50 مل من العازلة تحلل لإعادة إنفاق الكريات الخلية من 1 لتر من ثقافة الخلية.
  5. Lyse الخلايا عن طريق سونيكيشن لمدة 15 دقيقة، 3 ثوان على، و 3 ثوان قبالة. ثم خلايا الطرد المركزي في 37,888 x g لمدة 40 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا عن طريق تجميد الخلايا قبل صوتنة في ثلاجة -80 درجة مئوية.
  6. تحميل supernatant في عمود الجاذبية الكوبالت (قطر × طول: 2.5 سم × 10 سم) مع ~ 10mL من الخرز قبل equilibrated مع 5-10 أحجام العمود (CV) من العازلة تحلل.
  7. غسل العمود مع 5 السيرة الذاتية من العازلة B (50 mM تريس-HCl pH 7.4, 1 M NaCl, 10٪ الجلسرين, و 5 mM imidazole) و 5 السيرة الذاتية من العازلة C (50 mM تريس-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl, 10٪ الجلسرين, و 5 mm imidazole).
  8. Elute البروتين من الخرز باستخدام 2 السيرة الذاتية من D العازلة (50 mM تريس-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl, و 250 mM imidazole).
  9. تمييع البروتين الملتح 5x مع العازلة QA (50 mM تريس-HCl pH 8.0, 5٪ الجلسرين) لعمود Q.
  10. اغسل عمود Q الذي تبلغ مساحته 5 مل باستخدام المخزن المؤقت QA لموازنة العمود، ثم قم بتحميل العينة المخففة في عمود Q باستخدام المضخة العسيرة (مثل الأرنب).
  11. تحميل العمود Q في الجهاز HPLC جنبا إلى جنب مع المخزن المؤقت QA و QB المخزن المؤقت (50 mM تريس-HCl pH7.4, 1.5 M NaCl, 5٪ glycerol). إعداد معدل التدفق على أنه 1 مل/دقيقة.
  12. تشغيل برنامج "غسل مضخة" لغسل الجهاز مع المخزن المؤقت QB متبوعا المخزن المؤقت QA (1-2 السير الذاتية / كل). تعيين تدفق النظام إلى 3 مل/دقيقة.
  13. تعيين UV1 إلى 280 نانومتر وUV2 إلى 260 نانومتر. استخدام لوحة 96 بئر عميق لجمع الكسور.
  14. البروتينات Elute باستخدام تدرج تدريجي من عامل elution (QB العازلة) تطبيق السيرة الذاتية 3-4 من كل تركيز، وزيادة النسبة المئوية بنسبة 5٪ في كل مرة تبدأ من 0٪ QB. N0P بروتين مجمع سوف يخرج في 15٪ QB العازلة.
  15. مرة واحدة يتم يسل كل من البروتين، وغسل العمود مع 100٪ QB العازلة (2 CV).
  16. عزل البروتين بواسطة هلام الترشيح Superdex 200 زيادة 10/300 GL العمود (قطر × طول: 1.0 سم × 30 سم) والاعتدال مع العازلة E (20 mM HEPES pH 7.4 و 200 mM NaCl).
  17. تحليل الكسور المحتوية على البروتين بواسطة SDS-PAGE.

3. في التجمع المختبري من NC الفيروسات محددة

ملاحظة: تم تنفيذ التجميع في المختبر من NC RSV محددة (N:RNA) من خلال احتضان مجمع N0P المعدة مع أوليغوس الجيش الملكي النيبالي. ثم، تم استخدام الكروماتوغرافيا SEC لفصل مجمع التجميع من N0P والحمض النووي الريبي الزائد(الشكل 2).

  1. مزيج واحتضان منقى N0P مجمع مع RNA oligo مع النسبة الجزيئية من 1:1.5 في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة, عادة 1 مل من البروتين N0P مع تركيز 1 ملغم / مل يكفي للخطوة التالية. إعداد عينة التحكم، والتي تحتوي فقط على نفس الكمية من البروتين N0P.
  2. قبل equilibrate جل الترشيح Superdex 200 زيادة 10/300 GL العمود مع E العازلة (20 م م HEPES، pH 7.4، 200 M M NaCl).
  3. طرد مركزي العينة مع 21,130 x g لمدة 15 دقيقة, إزالة أي هطول الأمطار وتحميل supernatant إلى العمود لجنة الأوراق المالية والبورصة.
  4. قارن الصور الكروماتوغرافية SEC من عينة تجميع N:RNA وعينة التحكم N0P ، والجمع بين نسبة A260/ A280 لتحديد القمم التي هي N-RNA المجمعة ، N0P ، والجيش الملكي النيبالي المجاني.
  5. جمع الكسور الذروة، تشغيل هلام SDS-PAGE، أو جعل الشبكات.
  6. للجمعية N-RNA المعقدة، وجمع جميع الكسور من ذروة ن-الجيش الملكي النيبالي، لا استخراج الجيش الملكي النيبالي وتشغيل هلام Urea-PAGE للتحقق مرتين من طول الحمض النووي الريبي محددة، وهو نفس مختلطة واحتضانها في الخطوة الأولى.

4. جعل شبكات بقع سلبية

ملاحظة: المجهر الإلكتروني السلبي للبقع (EM) هو طريقة يتم فيها امتزاز الجزيئات إلى فيلم كربوني ثم تضمينها في طبقة من ذرات المعادن الثقيلة. السلبي وصمة عار EM تنتج تباين صورة عالية، مما يجعل من السهل أن نرى ومحاذاة حسابيا الجسيمات. ميزة أخرى هي أن الامتزاز للجسيمات إلى فيلم الكربون عادة ما يحفز الجزيئات على الالتزام بالشبكة مع عدد قليل من التوجهات المفضلة. عندما تكون الجزيئات في اتجاه مماثل ، فمن السهل فصلها إلى فئات متميزة هيكليا. وصمة عار سلبية EM وبالتالي الأسلوب المناسب لتوجيه إعداد عينة25،26 ( الشكل3).

  1. الميكروويف أو الحرارة 5 مل من ddH2O في كوب زجاجي صغير باستخدام سخان التنغستن حتى يغلي.
  2. وزن 37.5 ملغ من أورانيل formate وإضافة إلى 5 مل من DDHساخنة 2O لجعل محلول تلطيخ أورانيل 0.75٪. اثارة تحت رقائق الألومنيوم غطت الكأس للحماية من الضوء.
  3. أضف 4 ميكرولتر من 10 M NaOH إلى محلول التلطيخ و استمر في التقليب لمدة 15 دقيقة ، محمية من الضوء.
  4. قم بتصفية الحل من خلال فلتر 0.22 مم في أنبوب اختبار.
  5. استخدام توهج التفريغ لجعل شبكات EM المغلفة بالكربون المستمر hydrophilic27.
    ملاحظة: يتم وضع الشبكات داخل غرفة متصلة بإمدادات الطاقة. عندما يتم تطبيق الجهد العالي، والغاز داخل الغرفة يأين، وترسب الأيونات المشحونة سلبا على شبكات الكربون لجعلها هيدروفيلي.
  6. قطع وأضعاف شريط بارا فيلم. Pipet 2 قطرات من 40 ميكرولتر من العازلة على جانب واحد من البارافيلم، وماصة أخرى 2 قطرات من 40 ميكرولتر من محلول تلطيخ إلى الجانب الآخر.
  7. لجعل شبكات الكربون EM، وتطبيق 3 ميكرولتر من عينة البروتين لمدة 1 دقيقة.
  8. لطخ الشبكات مقابل ورقة النشاف.
    ملاحظة: يتم غسل الشبكات 2x مع المخزن المؤقت، و 1x مع محلول تلطيخ أورانيل 0.75٪ تلطيخ بعد كل خطوة.
  9. عقد سطح الشبكة في الانخفاض الثاني من 0.75٪ محلول تلطيخ أورانيل formate لمدة 30 ثانية.
  10. لطخ الشبكة ضد ورقة النشاف لإزالة محلول البقع الزائدة والسماح للشبكة بتجفيف الهواء.
  11. تخزين الشبكات في مربع الشبكة قبل التصوير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تنقية بروتين N0P الخالي من الحمض النووي الريبي
مع هذا البروتوكول، يمكن الحصول على مركب RSV N0P القابل للذوبان على نطاق واسع. تم التعبير عن الطول الكامل للجزء N و N النهائي من بروتينات P مع 10X His-Tag على بروتين N في الإشريكية القولونية. تم تنقية N0P باستخدام عمود الكوبالت، وتبادل الأيونات، واللونيات استبعاد الحجم. N0P يحتوي على كل من N كامل طول و N محطة P ولكن لا تحتوي على الحمض النووي الريبي الخلوية على أساس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية A260/A280 نسبة 20 (الشكل 4).

تجميع ن الجيش الملكي النيبالي والتحقق مع وصمة عار سلبية
ثم أثبتنا أنه يمكن تحفيز N0P المنقى وتجميعه في جزيئات تشبه Nuceloplasmid (NCLPs) من خلال احتضان أوليغو الحمض النووي الريبي المحدد. تم تجميع NCLPs عن طريق احتضان N0P مع أوليغوس الحمض النووي الريبي بنسبة 1:1.5 في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ثم تشغيل من خلال عمود الترشيح هلام. عندما أشكال معقدة N:RNA، فإنه يظهر ثلاث قمم:ذروة سانت 1 هو N:RNA، و2nd الذروة هو N0P، و3RD الذروة هو الجيش الملكي النيبالي الحرة الزائدة. أعلى جزء من الذروة N:RNA يخلق شبكات وصمة عار سلبية للتحقق مع EM20 (الشكل 5).

Figure 1
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 الرسم التوضيحي للإنشاءات البلازميد. A. بناء RSV N1-391; B. بناء RSV P1-126; جيم - بناء ثنائي cistronic لexpression من N1-391 و P1-126. الجين الأول RSV N1-391، الجين الثاني RSV P1-126، الجين المقاوم للمضادات الحيوية (AmpR) ، ويتم تسليط الضوء على المروجين في صناديق صفراء وسيان ووردية وبرتقالية ، على التوالي. وباختصار، يتم إنشاء إدراج الجينات من RSV N1-391 و RSV P1-126 بشكل منفصل وتجميعها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم المخطط الانسيابي لتنقية البروتين مجمع N1-391P1-126. وهو يحدد التطعيم والنمو على نطاق واسع من زراعة خلايا الإشريكية القولونية وحصاد الخلية عن طريق الطرد المركزي. تليها تحلل الخلية، يتم تنقية عينات البروتين من قبل الكروماتوغرافيا تقارب (أي، Co2 + العمود)، الكروماتوغرافيا تبادل الأيونات (أي عمود Q)، واستبعاد حجم الترشيح هلام (SEC) الكروماتوغرافيا. يتم تحليل عينات البروتين بشكل أكبر بواسطة هلام SDS-PAGE. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن إعداد شبكات EM وصمة عار سلبية للتصوير. A. توهج تصريف الشبكات. B. يظهر الإجراء لشبكات تلطيخ السلبية. وتستخدم ملاقط لالتقاط الشبكة، تليها تطبيق عينة البروتين لمدة 1 دقيقة. الشبكات ملطخة بورق النشاف. يتم غسل الشبكة مرتين مع العازلة ومرتين مع محلول تلطيخ أورانيل 0.75٪. يتم الاحتفاظ الشبكات في انخفاض محلول تلطيخ الثاني لمدة 30 ثانية. يتم مسح الشبكات بعد كل غسل وتجفيف الهواء بعد النشاف النهائي. ج. يتم تخزين الشبكات في مربع الشبكة للتصوير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال النتائج التمثيلية لتكسيد N1-391P1-126 المعقدة. A. الملف الشخصي للجنة الأوراق المالية والبورصة من N1-391P1-126. B. الملف الشخصي للمجلس الأعلى للتعليم للجمعية N1-391P1-126 مع الجيش الملكي النيبالي. C. هلام SDS-PAGE يظهر البروتين N فقط لمجمع N-RNA والعصابات لكل من N و P البروتينات من N1-391P1-126 المعقدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5 - الأرقام 5- الأرقام التي تم صور تمثيلية من N-RNA. A و B هي ممثل السلبية وصمة عار EM صور ن-RNA من N1-391-RNA الذروة في الشكل 4. مجمعات N-RNA ملطخة باستخدام الإجراء الموضح في الشكل 3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الاشعال
N1-391 إلى الأمام 5'-تكتكاتكااتكاتكاتغكاتغاغاغاغ-3'
N1-391 عكس 5'-TTATCCACTTCCAATGTTATTACCCGGTTCCTTGG-3'
P1-126 إلى الأمام 5'-تكتكاتكااتكاتجاجاجتكتكسكوجاج-3'
P1-126 عكس 5'-TTATCCACTTCCAATGTTATTACTGGGTTTTCCTCGTAGC-3'

الجدول 1 - الجداول تسلسلات التمهيدي.

تضخيم PCR لإدراج الحمض النووي
15 ميكرولتر 10x بفو بوليمراز التفاعل العازلة
3 ميكرولتر التمهيدي الأمامي (تركيز 100 ميكرومتر)
3 ميكرولتر التمهيدي العكسي (تركيز 100 ميكرومتر)
15 ميكرولتر مزيج dNTP بتركيز 2.5 mM
6 ميكرولتر الحمض النووي البلازميد يحتوي على جين N أو P (100ng / μL)
7 ميكرولتر DMSO
3 ميكرولتر بفو بوليمراز في 2.5U/μL
حجم التعبئة إلى 150 ميكرولتر معقم ddH2O

الجدول 2 - الأرباح تضخيم PCR من الحمض النووي إدراج الكواشف.

تضخيم PCR لإدراج الحمض النووي
درج الوقت درجة الحرارة دورات
التشبع 4 دقائق. 95 درجة مئوية 1
التشبع 45 ثانية. 95 درجة مئوية 30
الصلب 30 ثانية. 62 درجة مئوية
تمديد* 90 ثانية. 72 درجة مئوية
امتداد 10 دقائق. 72 درجة مئوية 1
مسك ∞ 4 درجات مئوية 1
يمكن تشغيل خليط 150 ميكرولتر في ثلاثة ردود فعل PCR منفصلة (3 × 50μL).
* بالنسبة لبلمرة الحمض النووي Pfu ، 1 كيلوبايت / دقيقة هي السرعة الموصى بها لمرحلة التمديد. هنا، كل من أطوال الجين N1-391 أو الجين P1-126 أقصر من 1.5 Kb.
وهكذا، تم استخدام 90 ثانية لخطوة التمديد.

الجدول 3 - الأرباح PCR تضخيم الحمض النووي إدراج برنامج الدراجات الحرارية.

T4 علاج بوليمرات الحمض النووي
10 × المخزن المؤقت 2 ميكرولتر
ناقل / إدراج الحمض النووي (0.1 ناقلات pmol أو إدراج 0.2 pmol) 5 ميكرولتر
dNTP* عند 25 متر م 2 ميكرولتر
DTT عند 100 متر 1 ميكرولتر
T4 بوليمرات الحمض النووي (LIC المؤهلين) 0.4 ميكرولتر (1.25 U)
معقم ddH2O 9.6 ميكرولتر
*تم استخدام dGTP للمتجه، واستخدم dCTP لإدراج الحمض النووي.

الجدول 4 - الأرباح T4 الحمض النووي بوليمراز العلاج.

تداخل PCR
15 ميكرولتر 10 X بفو بوليمراز تفاعل العازلة
3 ميكرولتر التمهيدي الأمامي (100 ميكرومتر)
3 ميكرولتر التمهيدي العكسي (100 ميكرومتر)
15 ميكرولتر dNTP ميكس (2.5 mM)
3 ميكرولتر DNA من 1st جولة PCR التي تحتوي على الجين N1-391 (100 نانوغرام / ميكرولتر )
3 ميكرولتر DNA من 1st جولة PCR التي تحتوي على الجين P1-126 (100 نانوغرام / ميكرولتر )
7 ميكرولتر DMSO
3 ميكرولتر بفو بوليمراز (2.5 U/μL)
حجم التعبئة إلى 150 ميكرولتر معقم ddH2O

الجدول 5 - الأرباح تراكب الكواشف PCR.

تداخل PCR
درج الوقت درجة الحرارة دورات
التشبع 4 دقائق. 95 درجة مئوية 1
التشبع 45 ثانية. 95 درجة مئوية 30
الصلب 30 ثانية. 62 درجة مئوية
تمديد* دقيقتان. 72 درجة مئوية
امتداد 10 دقائق. 72 درجة مئوية 1
مسك ∞ 4 درجة مئوية 1
يمكن تشغيل خليط 150 ميكرولتر في ثلاثة ردود فعل PCR منفصلة (3 × 50 ميكرولتر).
* بالنسبة لبلمرة الحمض النووي Pfu ، 1 كيلوبايت / دقيقة هي السرعة الموصى بها لمرحلة التمديد. هنا، الطول الإجمالي للجين N1-391 و P1-126 أقصر من 2.0 Kb. وهكذا، تم استخدام دقيقتين لخطوة التمديد.

الجدول 6 - الأرباح تداخل برنامج PCR للدراجات الحرارية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الجسيمات المعروفة الشبيهة بالنيوكليوكابسيد (NCLP) هياكل غير المقوسة السلبية الشعور (NNS) فيروسات الحمض النووي الريبي تبين أن NCLPs تجميعها هي N معقدة مع الحمض النووي الريبي الخلوي المضيف عندما مفرط في التعبير في أنظمة التعبير البكتيرية أو eukaryotic15,16,17,18,19. وقد حاولت الدراسات السابقة للحصول على ن الجيش الملكي النيبالي الحرة مع مجموعة متنوعة من الأساليب, مثل RNase A الهضم, غسل الملح عالية, أو ضبط مختلف المخازن المؤقتة درجة الحموضة لإزالة الحمض النووي الريبي الخلوية غيرمحددة 28,29. ومع ذلك، يمكن استخدام أي من الطرق المذكورة أعلاه بنجاح لتجميع NCs الخاصة بالفيروسات. للحصول على RSV N الخالي من الحمض النووي الريبي ، حاولنا أيضا مجموعة من الأساليب ، بما في ذلك هضم RNase A ، وغسل الملح العالي (1.5M NaCl) ، وضبط درجة الحموضة العازلة من درجة الحموضة 5.0 إلى درجة الحموضة 9.0 ، وتشبع البروتين وإعادة التشبع. بعد العديد من التجارب الفاشلة، ونحن لا تزال لا يمكن الحصول على N خالية من الجيش الملكي النيبالي مع الأساليب المذكورة أعلاه. وسنناقش بإيجاز المحاولات والأسباب المحتملة.

طريقة واحدة للحصول على N خالية من الحمض النووي الريبي هو لهضم الحمض النووي الريبي الخلوي المضيف في NCLPs تجميعها مع RNase A.  في VSV، واحتضان NCLP تنقية مع RNase A بتركيز نهائي من 1mg/ml في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة إزالة تماما الحمض النووي الريبي من NC28. ثم احتضنت تنقية oligomeric N فارغة مع بولي ألف (250-NT أو أكثر) في نسبة الضرس من 1:5 في وجود مثبطات RNase. تحليل الحمض النووي الريبي معزولة عن إعادة تشكيل N:poly-A أظهرت أن الجيش الملكي النيبالي كان ما يقرب من 90 NT في الطول. وهذا يشير إلى أن الحمض النووي الريبي خارج النوى عرضة للهضم غير محدد من قبل RNase A الملوثة من الخطوة السابقة. لم تنجح استراتيجية RNase A للهضم لإزالة الحمض النووي الريبي عند تطبيقها على RSV. وقد يكون ذلك بسبب سببين. أولا، سوف RNase A الملوثة هضم الحمض النووي الريبي RSV محددة، والتي سيتم احتضانها في وقت لاحق وتجميعها مع N. ثانيا، كفاءة عملية الهضم RNase A أقل بكثير في RSV. وذلك لأن RNAs تجميع مختلف في فيروسات NNS مختلفة. الهياكل الكريستالية المعروفة من N:RNA تبين أن الحمض النووي الريبي يربط خارج NC في VSV, ولكن داخل NC في RSV30,31. تكوين ربط الحمض النووي الريبي إلى الداخل من NC قد يؤدي إلى انخفاض كفاءة لRNase A للوصول والهضم.

طريقة أخرى للحصول على N خالية من الحمض النووي الريبي هو جعل اقتطاعات التي تقطع كل من عزر N-المحطة الطرفية (N-الذراع) وC-محطة عزر (C-الذراع) من N. ومع ذلك، لا يمكن استخدام هذا N خالية من الحمض النووي الريبي مبتورة لتجميع مع الجيش الملكي النيبالي في NC مستقرة لأن N-الذراع من N مطوية في الوحدات الفرعية المجاورة لها عن طريق التفاعل مع المجال C-المحطة الطرفية (CTD) من الوحدة الفرعية N السابقة. يتم وضع الذراع C الموسعة إلى CTD من وحدة N الفرعية التالية31.

وهناك طريقة إضافية للحصول على N خالية من الحمض النووي الريبي هو إعداد N متحولة. على سبيل المثال، أظهرت النتيجة التي حصلت عليها Galloux وآخرون أن RSV RNA مجانا N 0 P مجمع يمكنالحصولعليها عن طريق التعبير المشترك من K170A/R185A مزدوج N متحولة مع N-terminus من P في البكتيريا32. ومع ذلك، فإن لديها مسألتين محتملتين لمزيد من التوصيفات الهيكلية. وتتمثل إحدى القضايا في انخفاض استقرار هذا المجمع المتحول بتركيزات عالية. المسألة الأخرى هي أن مجمع متحولة فقدت القدرة على ربط الجيش الملكي النيبالي، والتي لا يمكن استخدامها في الخطوة التالية من التجمع.

على الرغم من التحديات الهائلة، أنشأنا وتحسين البروتوكول للحصول على NCs فيروس محدد باستخدام التعبير المشترك من N مع مرافق P. في الآونة الأخيرة، طريقة ناجحة أخرى هي لجعل ترميز البناء الانصهار chimeric لP1-50-TEV-N1-405-8xHisل MeV33،34. N 0 P يمكنالحصولعليها بعد الانقسام بروتياز TEV. يعتمد نقاء N0P على كفاءة انشقاقات TEV ، والتي تقطع الانصهار بين بروتين N وP.

بدلا من استخدام طريقة الانصهار الشيمي، قمنا بتصميم بناء ثنائية الكزترونيك. على وجه التحديد ، تم تصميم وهندسة بنيات التعبير المشترك لمجمع N0P في إطارين مفتوحين للقراءة ، يتألفان من الطول الكامل ل N (1-391) مع علامة 10x His في N-terminal في ORF الأولى ، والببتيدات N-terminal (1-126) من P في ORF20الثاني. باختصار ، فإن الإجراء العام لتنقية N0P هو تنقية N0P و N-RNA الموسومة به من عينات التحلل الخلوي مع حبات الكوبالت ، وإزالة الحمض النووي الريبي غير المحدد ومجمع N:cellular RNA مع عمود Q ، والحصول على مجمع N0P النقي مع عمود SEC. في خطوة لجنة الأوراق المالية والبورصة، يمكن رصد نسبة A260/A280 والتحقق منها مرتين مع استخراج الحمض النووي الريبي من كسور الذروة N0P.

بشكل جماعي ، في هذا البروتوكول ، فإن أهم الخطوات هي استراتيجية تصميم بناء التعبير المشترك لمجمع N0P واستخدام سلسلة من التقارب وعمود التبادل الأيوني لفصل مجمع RNA N0P المجاني عن مجمعات الحمض النووي الريبي N-cellular الأخرى. كفاءة استراتيجية التعبير المشترك للحصول على N0P معقدة منخفضة نسبيا; حوالي 50٪ N البروتين لا يزال N الخلوية RNA المعقدة. ويمكن أيضا أن يطبق البروتوكول للحصول على RNA مجانا N0P والتجمع مع الجيش الملكي النيبالي محددة مع N للحصول على N:RNA معقدة من الفيروسات NNS الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

ويدعم البرامج البحثية في مختبر ليانغ في إيموري المعهد الوطني الأمريكي للعلوم الطبية العامة (NIGMS)، والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) تحت رقم الجائزة R01GM130950، وصندوق بدء البحث في كلية الطب بجامعة إيموري. ويعترف صاحب البلاغ بأعضاء مختبر ليانغ للدعم المفيد والمناقشة النقدية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose SIgma A9539-500G making construct using LIC method
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Millipore UFC901024 concentrate the protein sample
Ampicillin sodium GOLD BIOTECHNOLOGY 5118.111317A antibiotic for cell culture
AseI NEB R0526S making construct using LIC method
Cobalt (High Density) Agarose Beads Gold Bio H-310-500 For purification of His-tag protein
Corning LSE Digital Dry Bath Heater CORNING 6885-DB Heate the sample
dCTP Invitrogen 10217016 making construct using LIC method
dGTP Invitrogen 10218014 making construct using LIC method
Glycerol Sigma G5516-4L making solution
HEPES Sigma H3375-100G making solution
HiTrap Q HP Sigma GE29-0513-25 Protein purification
Imidazole Sigma I5513-100G making solution
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) GOLD BIOTECHNOLOGY 1116.071717A induce the expression of protein
Microcentrifuge Tubes VWR 47730-598 for PCR
Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor SpectraLab MSX-XL-2020 sonicator for lysing cell
Negative stain grids Electron Microscopy Sciences CF400-Cu-TH For making negative stain grids
New Brunswick Innova 44/44R eppendorf M1282-0000 Shaker for culturing the cell
Nonidet P 40 Substitute Sigma 74385-1L making solution
OneTaq DNA Polymerase NEB M0480L PCR
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28706 Purify DNA
SSPI-HF NEB R3132S making construct using LIC method
Superose 6 Increase 10/300 GL Sigma GE29-0915-96 Protein purification
T4 DNA polymerase Sigma 70099-3 making construct using LIC method
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge Fisher Scientific 36-101-0816 Centrifuge, highest speed 20,000 rpm
Trizma hydrochloride Sigma T3253-250G making solution
Uranyl Formate Electron Microscopy Sciences 22451 making negative stain solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).
  2. Lamb, R. A. Fields virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. (2013).
  3. Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease. Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).
  4. Fearns, R., Deval, J. New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase. Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).
  5. Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA. Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).
  6. Pan, J., et al. Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex. Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).
  7. Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).
  8. Cao, D., et al. Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase. Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).
  9. Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).
  10. Gilman, M. S. A., et al. Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex. Cell. 179 (1), 193-204 (2019).
  11. Liang, B., et al. Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy. Cell. 162 (2), 314-327 (2015).
  12. Jenni, S., et al. Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor. Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).
  13. Renner, M., et al. Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein. Elife. 5, 12627 (2016).
  14. Cox, R. M., Plemper, R. K. Structure and organization of paramyxovirus particles. Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).
  15. Desfosses, A., et al. Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape. Nature Communications. 4, 1429 (2013).
  16. Green, T. J., et al. Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).
  17. Jamin, M., Yabukarski, F. Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly. Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).
  18. Wan, W., et al. Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid. Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).
  19. Mendes, A., Kuhn, R. J. Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly. Viruses. 10 (3), (2018).
  20. Gao, Y., et al. In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus. Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).
  21. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
  22. Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).
  23. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
  24. Green, R., Rogers, E. J. Transformation of chemically competent E. coli. Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).
  25. De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
  26. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).
  27. Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).
  28. Green, T. J., et al. Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).
  29. Alvarez Paggi, D., et al. A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model. Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).
  30. Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex. Science. 313 (5785), 357-360 (2006).
  31. Tawar, R. G., et al. Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus. Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).
  32. Galloux, M., et al. Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein. Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).
  33. Milles, S., et al. Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence. Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).
  34. Desfosses, A., et al. Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 173، الجيل، التجميع، فيروس التزامن التنفسي (RSV)، فيروس محدد، الحمض النووي الريبي، النوكليوكابسيد (NC)، مرافق، ريبونوكليوبروتين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gao, Y., Ogilvie, C., Raghavan, A.,… More

Gao, Y., Ogilvie, C., Raghavan, A., Von Hoffmann, C., Liang, B. Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus. J. Vis. Exp. (173), e62010, doi:10.3791/62010 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter