Summary
For grundig mekanistisk analyse av respiratorisk synytialvirus (RSV) RNA-syntese, rapporterer vi en protokoll for bruk av chaperone fosfoprotein (P) for samtidig undertrykkelse av RNA-frie nukleoprotein (N0) for etterfølgende in vitro-montering av de virusspesifikke nukleocapsidene (NCs).
Abstract
Bruken av en autentisk RNA-mal er avgjørende for å fremme den grunnleggende kunnskapen om viral RNA-syntese som kan lede både mekanistisk oppdagelse og analyseutvikling i virologi. RNA-malen med ikke-segmenterte NNS-RNA-virus (negative sanser), for eksempel det respiratoriske synytialviruset (RSV), er ikke et RNA-molekyl alene, men snarere et nukleoprotein (N) innkapslet ribonukleoproteinkompleks. Til tross for viktigheten av den autentiske RNA-malen, forblir genereringen og monteringen av et slikt ribonukleoproteinkompleks sofistikert og krever dyptgående belysning. Hovedutfordringen er at de overekspresserte RSV N binder seg ikke spesifikt til cellulære RNAer for å danne tilfeldige nukleocapsid-lignende partikler (NCLPer). Her etablerte vi en protokoll for å få RNA-fri N (N0) først ved å uttrykke N med et anstandsfosfoprotein (P), og deretter montere N0 med RNA oligos med den RSV-spesifikke RNA-sekvensen for å oppnå virusspesifikke nukleocapsids (NCs). Denne protokollen viser hvordan du kan overvinne vanskeligheten i utarbeidelsen av dette tradisjonelt utfordrende virale ribonukleoproteinkomplekset.
Introduction
Ikke-segmentert negativ sans (NNS) RNA-virus inkluderer mange betydelige menneskelige patogener, for eksempel rabies, ebola og respiratorisk synytialvirus (RSV)1,2. RSV er den ledende årsaken til luftveissykdom som bronkiolitt og lungebetennelse hos små barn og eldre voksne over hele verden3. For tiden er ingen effektive vaksiner eller antivirale terapier tilgjengelige for å forhindre eller behandle RSV4. Som en del av livssyklusen fungerer RSV-genomet som mal for replikering av RSV RNA-avhengig RNA-polymerase for å produsere et antigenom, som igjen fungerer som mal for å generere et avkomgenom. Både genom og antigenom RNAer er helt innkapslet av nukleoproteinet (N) for å danne nukleocapsids (NCs)3. Fordi NCene fungerer som maler for både replikering og transkripsjon av RSV-polymerasen, er riktig NC-montering avgjørende for polymerase for å få tilgang til malene for RNA-syntese5. Interessant, basert på de strukturelle analysene av NNS virale polymeraser, er det hypoteset at flere N-proteiner midlertidig dissosierer fra NCene for å tillate tilgang til polymerase og rebind til RNA etter RNA-syntesen6,7,8,9,10,11,12.
For tiden er RSV RNA-polymerisasjonsanalysen etablert ved hjelp av renset RSV-polymerase på korte nakne RNA-maler13,14. RSV-polymerasens aktiviteter når imidlertid ikke optimale, som observert i de ikke-prosessive og abortive produktene som genereres av RSV-polymerasen ved bruk av nakne RNA-maler. Mangelen på NC med virusspesifikk RNA er en primærbarriere for den videre mekanistiske forståelsen av RSV RNA-syntesen. Derfor blir bruk av en autentisk RNA-mal et kritisk behov for å fremme den grunnleggende kunnskapen om RSV RNA-syntese. De kjente strukturene til nukleocapsid-lignende partikler (NCLPer) fra RSV og andre NNS RNA-virus avslører at RNAene i NCLPene enten er tilfeldige cellulære RNAer eller gjennomsnittlig viral genomiske RNAer15,16,17,18,19. Sammen er det viktigste hinderet at N binder seg ikke spesifikt til cellulære RNAer for å danne NCLPer når N er overekspressert i vertscellene.
For å overvinne dette hinderet etablerte vi først en protokoll for å få RNA-fri (N0) og montere N0 med autentisk viral genomisk RNA i NCLPer20. Prinsippet i denne protokollen er å oppnå en stor mengde rekombinant RNA-fri N (N0) ved å uttrykke N sammen med en anstand, N-terminaldomenet til RSV fosfoprotein (PNTD). Den rensede N0P kan stimuleres og monteres i NCLPer ved å legge til RSV-spesifikke RNA oligos, og under monteringsprosessen forskyver chaperone PNTD ved tillegg av RNA oligos.
Her beskriver vi en protokoll for generering og montering av RSV RNA-spesifikke NCer. I denne protokollen beskriver vi molekylær kloning, proteinpreparat, in vitro-montering og validering av den komplekse samlingen. Vi fremhever kloningsstrategien for å generere bi-cistronic konstruksjoner for proteinkoekspressjon for molekylær kloning. For proteinpreparat beskriver vi prosedyrene for cellekultur, proteinutvinning og rensing av proteinkomplekset. Deretter diskuterer vi metoden for in vitro-montering av RSV RNA-spesifikke NCer. Til slutt bruker vi størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) og negativ flekkelektronmikroskopi (EM) for å karakterisere og visualisere de monterte NCLPene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Molekylær kloning
MERK: Ligase Independent Cloning (LIC) ble brukt til å lage en RSV bi-cistronic coexpression konstruksjon plasmid. LIC er en metode utviklet tidlig på 1990-tallet, som bruker 3'-5' Exo-aktiviteten til T4 DNA-polymerasen for å skape overheng med komplementaritet mellom vektoren og DNA-innsatsen21,22. Konstruksjonene ble laget ved hjelp av 2BT-10 vektor-DNA, som består av en 10x Hans tag på N-terminalen til Open Reading Frame (ORF) (Figur 1).
- Utfør linearisering av LIC-vektorer ved hjelp av SSPI-fordøyelsen.
- Kombiner 10 μL SSPI 10X buffer, 4 μL SSPI-enzym i en konsentrasjon på 5 U/μL, tilsvarende volum 5 μg vektorminiprep-DNA og steril ddH2O til 100 μL.
- Inkuber fordøyet i 3 timer ved 37 °C.
- Kjør fordøyelsen på en 1,0% agarose gel for utvinning av vektor-DNA.
- Bruk et gel ekstraksjonssett for å utføre ekstraksjon og rensing. Suspender det endelige volumet av vektor-DNA i 30 μL ddH2O og oppbevar det ved -20 °C.
- Forbered DNA-innsatsene for N1-391 og P1-126 ved hjelp av N1-391 Forward Primer, N1-391 Reverse Primer, P1-126 Forward Primer og P1-126 Reverse Primer (Tabell 1).
MERK: Det er tilstrekkelig overlapping med den lineariserte vektoren for å sikre en smeltetemperatur på mellom 55 °C og 60 °C. For den omvendte primeren er det tilstrekkelig overlapping med den omvendte komplementære strengen til den lineariserte vektoren av samme grunn.- Utfør PCR-forsterkning av DNA-innsatsen ved hjelp av forholdene i tabell 2 og tabell 3.
- Trekk ut den forsterkede DNA-innsatsen. Kjør PCR-produktene fra forrige trinn på en 1,0% agarose gel, trekk deretter ut og rense båndene ved gelutvinning. Suspender det endelige volumet av ekstrahert DNA i 15 μL ddH2O.
- T4 DNA-polymerasebehandling av vektor og sett inn DNA (Tabell 4).
MERK: Behandlingen må utføres separat for vektor-DNA og innsats-DNA.- Inkuber blandingen i 40 minutter ved romtemperatur. Deretter varme-inaktivere polymerase ved 75 °C i 20 minutter. Oppbevar reaksjonsblandingen ved -20 °C.
- Anneal LIC vektoren og innsatsvektoren.
- Sett opp en negativ kontroll med 2 μL LIC vektor DNA og 2 μL steril ddH2O.
- Kombiner 2 μL innsats-DNA og 2 μL LIC vektor-DNA fra de tidligere T4 DNA-polymerasereaksjonene i et 0,2 ml rør.
- Utfør glødereaksjonen ved romtemperatur i 10 minutter.
- Slukk reaksjonen med 1,3 μL EDTA i en konsentrasjon på 25 mM.
- Forvandle reaksjonen til 100 μL E. coli Top10 kompetente celler og plate dem på en ampicillin utvalg plate23,24.
- Identifiser de positive konstruksjonene.
- Forbered den plasmide miniprep-løsningen. Dette kan gjøres gjennom koloniplukking og inokulasjon i LB-medier. Vanligvis er 3 kolonier tilstrekkelig.
- Inkuber blandingen over natten ved 37 °C.
- Sentrifuger blandingen på 4560 x g i 10 minutter og kast supernatanten.
- Resuspend pellets i 250 μL P1 buffer og forberede plasmid minipreps ved hjelp av en spin miniprep kit.
- Utfør en fordøyelsesanalyse av miniprepproduktet ved hjelp av AseI eller andre begrensningsenzymer.
- Last prøver på 0,8% agarose gel og kjør den fordøyde plasmiden. Analyser gelen under en UV-lampe.
- Bruk en sekvenseringstjeneste til å validere sekvensen til det positive produktet.
- Få tak i DNA-innsatsen for samtidig undertrykkelse.
- Utfør PCR for å få N1-391 og P1-126 ved hjelp av den tidligere konstruerte 2BT-10 N1-391 og 2BT-10 P1-126 som maler.
- Utfør den 1st PCR for å få N1-391 fra 2BT-10 N1-391 konstruksjonen ved hjelp av PCR-forholdene i tabell 2 og tabell 3 med N1-391 Foroverprimer og revers primer 5 ́-GTGAAGATCCTGGCTGATGCAATGCGGCGGCG
CGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́. - Utfør denandre PCR for å få P1-126 fra 2BT-10 P1-126-konstruksjonen ved hjelp av Forward primer: 5'-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATCTTCACTGC
AGGACTCGAGTTCTAGA-3 ́og P1-126 Reversprimer (bruk PCR-forholdene i tabell 2 og tabell 3). - Til slutt, utfør overlapping PCR på de blandede produktene fra de forrige 2 PCR-reaksjonene for å slå sammen N1-391 og P1-126. Bruk N1-391 Fremoverprimer og P1-126 Reversprimer. Bruk PCR-betingelsene i tabell 5 og tabell 6.
- Bli med i vektoren og DNA-innsatsen.
- Behandle overlappings-PCR-produktet med T4 DNA-polymerase etter protokollen i trinn 1.3.
- Anneal LIC-vektoren og PCR-produktet etter protokollen i trinn 1.4.
- Identifiser de positive konstruksjonene etter protokollen i trinn 1.5.
2. Proteinuttrykk og rensing
MERK: Bruk E. coli til bi-cistronic konstruksjonen av coexpression av både N og P. Kultur cellene ved 37 °C, men utfør uttrykket ved redusert temperatur (16 °C) over natten. Rens proteinkompleksene gjennom en kombinasjon av koboltkolonne, ionutveksling og størrelseseksklusjonskromatografi (figur 2).
- Bruk E. coli BL21(DE3)-stammen til proteinproduksjon. Vokse 4 L cellekulturer ved 37 °C i LB (Luria Broth) medium til OD600 når 0,6.
- Senk temperaturen til 16 °C. En time senere, indusere uttrykket med 0,5 mM isopropyl 1-thio--D-galactopyranoside (IPTG) over natten.
- Sentrifuger cellene ved 4104 x g i 25 minutter og kast deretter supernatanten.
- Resuspend cellepellets i 200 ml lysisbuffer A (50 mM natriumfosfat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 5 mM imidazol, 10% glyserol og 0,2% NP40). Bruk 50 ml lysisbuffer for å resuspendere cellepellets fra 1 L cellekultur.
- Lyse cellene ved sonikering i 15 min, 3 sekunder på, og 3 sekunder av. Sentrifuger deretter celler på 37,888 x g i 40 min.
MERK: Protokollen kan settes på pause ved å fryse cellene før sonikering i en -80 °C fryser. - Legg supernatanten i en kobolt tyngdekraftskolonne (diameter x lengde: 2,5 cm x 10 cm) med ~10 ml perler forhåndsjustert med 5-10 kolonnevolumer (CV) lysisbuffer.
- Vask kolonnen med 5 CV buffer B (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 M NaCl, 10 % glyserol og 5 mM imidazol) og 5 CV buffer C (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl, 10 % glyserol og 5 mM imid).
- Elute proteinet fra perlene ved hjelp av 2 CV buffer D (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl og 250 mM imidazol).
- Fortynn det eluterte proteinet 5x med QA-buffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5% Glycerol) for Q-kolonnen.
- Vask 5 ml Q-kolonnen med QA-buffer for å likevekte kolonnen, og last deretter den fortynnede prøven inn i Q-kolonnen ved hjelp av den peristaltiske pumpen (f.eks. kanin).
- Last Q-kolonnen inn i HPLC-maskinen sammen med QA-buffer og QB-buffer (50 mM Tris-HCl pH7.4, 1,5 M NaCl, 5% glyserol). Sett opp strømningshastigheten som 1 ml/min.
- Kjør "pumpevask" -programmet for å vaske maskinen med QB-buffer etterfulgt av QA-buffer (1-2 CV-er / hver). Sett systemflyten til 3 ml/min.
- Sett UV1 til 280 nm og UV2 til 260 nm. Bruk en 96 dyp brønnplate for å samle fraksjonene.
- Elute proteiner ved hjelp av en trinnvis gradient av elution agent (QB Buffer) bruker 3-4 CV av hver konsentrasjon, øke prosentandelen med 5% hver gang starter på 0% QB. N0P proteinkompleks vil komme ut ved 15% QB Buffer.
- Når hele proteinet er unngått, vask kolonnen med 100% QB Buffer (2 CV).
- Isoler proteinet ved gelfiltrering Superdex 200 Øk 10/300 GL-kolonnen (diameter x lengde: 1,0 cm x 30 cm) og likevekt med buffer E (20 mM HEPES pH 7,4 og 200 mM NaCl).
- Analyser proteinholdige brøker ved hjelp av SDS-PAGE.
3. In vitro montering av den virusspesifikke NC
MERK: In vitro-monteringen av den RSV-spesifikke NC (N:RNA) ble utført ved å inkubere det forberedte N0P-komplekset med RNA oligos. Deretter ble SEC-kromatografi brukt til å skille monteringskomplekset fra N0P og overflødig RNA (figur 2).
- Bland og inkuber det rensede N0P-komplekset med RNA oligo med det molekylære forholdet 1:1.5 ved romtemperatur i 1 time, vanligvis 1 ml av proteinet N0P med en konsentrasjon på 1 mg / ml er nok for neste trinn. Sett opp kontrollprøven, som bare inneholder samme mengde N0P-protein.
- Pre-likevekt gelfiltrering Superdex 200 Øk 10/300 GL-kolonnen med bufferen E (20 mM HEPES, pH 7,4, 200 mM NaCl).
- Sentrifuger prøven med 21,130 x g i 15 min, fjern eventuell nedbør og last supernatanten til SEC-kolonnen.
- Sammenlign SEC-kromatografibildene av N:RNA-monteringsprøven og N0P-kontrollprøven, kombiner forholdet A260/A280 for å identifisere hvilke topper som er montert N-RNA, N0P og gratis RNA.
- Samle toppfraksjonene, kjør SDS-PAGE gel, eller lag rutenett.
- For montering N-RNA-komplekset, samle alle fraksjonene av N-RNA-toppen, gjør RNA-ekstraksjonen og kjør Urea-PAGE gel for å dobbeltsjekke lengden på spesifikk RNA, som er den samme som blandet og inkubert ved første trinn.
4. Lage negative flekkgitter
MERK: Negativ flekkelektronmikroskopi (EM) er en metode der molekylene adsorberes til en karbonfilm og deretter bygges inn i et lag med tungmetallatomer. Negativ flekk EM gir en høy bildekontrast, noe som gjør det enkelt å se og beregningsmessig justere partiklene. En annen fordel er at adsorpsjonen av partiklene til en karbonfilm vanligvis induserer molekylene til å holde seg til rutenettet med få foretrukne orienteringer. Når molekylene er i en lignende retning, er det lett å skille dem i strukturelt forskjellige klasser. Negativ flekk EM er dermed den riktige teknikken for å veilede prøvepreparering25,26 ( figur3).
- Mikrobølgeovn eller varme 5 ml ddH2O i et lite glassbeger ved hjelp av en Wolframvarmer til det kokes.
- Vei 37,5 mg uranylformat og tilsett 5 ml oppvarmet ddH2O for å lage en 0,75% uranylformatflekkeløsning. Rør under et aluminiumsfoliedekket beger for å beskytte mot lys.
- Tilsett 4 μL 10 M NaOH til fargingsløsningen og fortsett å røre i 15 min, beskyttet mot lyset.
- Filtrer oppløsningen gjennom et 0,22 mm filter i et reagensrør.
- Bruk glødutladning for å lage de kontinuerlige karbonbelagte EM-gitteret hydrofil27.
MERK: Gitteret er plassert inne i et kammer som er koblet til en strømforsyning. Når høy spenning påføres, ioniserer gassen i kammeret, og de negativt ladede ionene avsetter på karbongitteret for å gjøre dem hydrofile. - Klipp og brett en parafilmstrimmel. Pipet 2 dråper av 40 μL av bufferen på den ene siden av parafilmen, og rør ytterligere 2 dråper 40 μL fargeløsning til den andre siden.
- For å lage EM karbongitter, bruk 3 μL proteinprøve i 1 minutt.
- Flekk gitteret mot et blottingspapir.
MERK: Gitteret vaskes 2x med buffer, og 1x med 0,75% uranyl formate farging løsning blottet etter hvert trinn. - Hold rutenettoverflaten i den andre dråpen på 0,75% uranylformat fargeløsning i 30 sekunder.
- Flekk rutenettet mot et blottingspapir for å fjerne overflødig flekkløsning og la gitteret lufttørke.
- Lagre rutenettene i rutenettboksen før du ser på dem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rensing av RNA-fri N0P protein
Med denne protokollen kan et storskala løselig heterodimerisk RSV N0P-kompleks oppnås. Hele lengden på N- og N-terminaldelen av P-proteiner ble uttrykt sammen med 10X His-Tag på N-proteinet i E. coli. N0P ble renset ved hjelp av en koboltkolonne, ionutveksling og størrelseseksklusjonskromatografi. N0P inneholder både N- og N-terminal P i full lengde, men inneholdt ikke cellulær RNA basert på UV-absorbansen A260/A280 ratio20 (Figur 4).
Montering av N-RNA og kontroll med negativ flekk
Vi demonstrerte deretter at renset N0P kunne stimuleres og monteres i Nuceloplasmid-lignende partikler (NCLPer) ved å inkubere med spesifikke RNA oligos. NCLP-ene ble montert ved å inkubere N0P med RNA oligos med forholdet 1:1,5 ved romtemperatur i 1 time og deretter løpe gjennom gelfiltreringskolonnen. Når N:RNA komplekse former, det viser tre topper: 1st toppen er N:RNA, denandre toppen er N0P, og 3rd toppen er overflødig fri RNA. Den høyeste brøkdelen av N:RNA-toppen skaper de negative flekkgitterene for kontroll med EM20 (figur 5).
Figur 1. Illustrasjonen av plasmidkonstruksjonene. en. Konstruksjonen av RSV N1-391; B. Konstruksjonen av RSV P1-126; C. Den to-cistroniske konstruksjonen for samtidig undertrykkelse av N1-391 og P1-126. Det første genet RSV N1-391, det andre genet RSV P1-126, det antibiotikaresistente genet (AmpR), og promotorene er fremhevet i henholdsvis gule, cyan, rosa og oransje bokser. Oppsummert er geninnsatsene til RSV N1-391 og RSV P1-126 konstruert separat og montert. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Flytskjemaet for rensing av proteinkomplekset N1-391P1-126. Den skisserer inokulasjonen og storskala oppvekst av E. coli-cellekulturen og høsting av cellen ved sentrifugering. Etterfulgt av cellelys, blir proteinprøvene renset av affinitetskromatografien (dvs. Co2+ kolonne), ionutvekslingskromatografi (dvs. Q-kolonne) og utelukkelse av gelfiltreringsstørrelse (SEC) kromatografi. Proteinprøvene analyseres videre av SDS-PAGE gel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Fremstilling av em-gitter med negativ flekk for avbildning. A. Glow slipper ut gitteret. B. Prosedyren for negative fargegitter vises. Pinsettene brukes til å plukke opp et rutenett, etterfulgt av å bruke proteinprøven i 1 minutt. Gitteret er blottet med blotting papir. Gitteret vaskes to ganger med buffer og to ganger med 0,75% uranylformat fargeløsning. Gitteret holdes i det andre fargeløsningsfallet i 30 sekunder. Gitteret er blottet etter hver vask og lufttørket etter den endelige blottingen. C. Rutenettene lagres i rutenettboksen for avbildning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Representative resultater av kopurifisering av N1-391P1-126 komplekset. en. SEC-profilen til N1-391P1-126. B. SEC-profilen til forsamlingen N1-391P1-126 med RNA. C. SDS-PAGE gel viser N-proteinet bare for N-RNA-komplekset og båndene for både N- og P-proteiner i N1-391P1-126-komplekset. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. Representative bilder av N-RNA. A og B er representative negative flekk EM-bilder av N-RNA fra N1-391-RNA-toppen i figur 4. N-RNA-kompleksene er farget ved hjelp av prosedyren som er beskrevet i figur 3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Primere | |||
| N1-391 Fremover | 5'-TACTTCCAATCCAATGCAATGGCCCTGAGCAAAGTGAAG-3' | ||
| N1-391 Omvendt | 5'-TTATCCACTTCCAATGTTATTACAGTTCCACGTCGTTGTCCTTGG-3' | ||
| P1-126 Fremover | 5'-TACTTCCAATCCAATGCAATGGAAAAGTTCGCCCGAG-3' | ||
| P1-126 Omvendt | 5'-TTATCCACTTCCAATGTTATTACTGGTCGTTGATTTCCTCGTAGC-3' | ||
Tabell 1. Primer sekvenser.
| PCR-forsterkning av DNA-innsats | |
| 15 μL | 10x Pfu polymerase reaksjonsbuffer |
| 3 μL | Fremoverprimer (100 μM konsentrasjon) |
| 3 μL | Omvendt primer (100 μM konsentrasjon) |
| 15 μL | dNTP-blanding ved 2,5 mM konsentrasjon |
| 6 μL | Plasmid DNA inneholder genet til N eller P (100ng/ μL) |
| 7 μL | Dmso |
| 3 μL | Pfu polymerase ved 2,5U/μL |
| Volum som skal fylles til 150 μL | Steril ddH2O |
Tabell 2. PCR-forsterkning av DNA-innsatsreagenser.
| PCR-amplikasjon av DNA-innsats | |||
| skritt | Tid | temperatur | Sykluser |
| Denaturering | 4 min. | 95 ºC | 1 |
| Denaturering | 45 sek. | 95 ºC | 30 |
| Annealing | 30 sek. | 62 ºC | |
| Utvidelse* | 90 sek. | 72 ºC | |
| forlengelse | 10 min. | 72 ºC | 1 |
| holde | ∞ | 4 ºC | 1 |
| 150 μL-blandingen kan kjøres i tre separate PCR-reaksjoner (3 x 50μL). | |||
| *For Pfu DNA-polymerasen er 1 kb/min den anbefalte hastigheten for forlengelsesfasen. Her er begge lengdene på N1-391-genet eller P1-126-genet kortere enn 1,5 Kb. | |||
| Dermed ble 90 sekunder brukt til utvidelsestrinnet. | |||
Tabell 3. PCR-forsterkning av DNA-innsettingstermocycling-program.
| T4 DNA polymerase behandling | |
| Buffer på 10 x | 2 μL |
| Vektor/ Sett inn DNA (0.1 pmol vektor eller 0.2 pmol innsats) | 5 μL |
| dNTP* ved 25 mM | 2 μL |
| DTT ved 100 mM | 1 μL |
| T4 DNA-polymerase (kvalifisert for LIC) | 0,4 μL (1,25 U) |
| Steril ddH2O | 9,6 μL |
| *dGTP ble brukt til vektoren, og dCTP ble brukt til innsats-DNA. | |
Tabell 4. T4 DNA polymerase behandling.
| Overlapp PCR | |
| 15 μL | 10 X Pfu polymerase reaksjonsbuffer |
| 3 μL | Foroverprimer (100 μM) |
| 3 μL | Omvendt primer (100 μM) |
| 15 μL | dNTP-blanding (2,5 mM) |
| 3 μL | DNA fra 1m rund PCR som inneholder genet N1-391 (100 ng/μL ) |
| 3 μL | DNA fra 1m rund PCR som inneholder genet P1-126 (100 ng/μL ) |
| 7 μL | Dmso |
| 3 μL | Pfu-polymerase (2,5 U/μL) |
| Volum som skal fylles til 150 μL | Steril ddH2O |
Tabell 5. Overlapp PCR-reagenser.
| Overlapp PCR | |||
| skritt | Tid | temperatur | Sykluser |
| Denaturering | 4 min. | 95 °C | 1 |
| Denaturering | 45 sek. | 95 °C | 30 |
| Annealing | 30 sek. | 62 °C | |
| Utvidelse* | 2 min. | 72 °C | |
| forlengelse | 10 min. | 72 °C | 1 |
| holde | ∞ | 4 °C | 1 |
| 150 μL-blandingen kan kjøres i tre separate PCR-reaksjoner (3 x 50 μL). | |||
| *For Pfu DNA-polymerasen er 1 kb/min den anbefalte hastigheten for forlengelsesfasen. Her er den totale lengden på genet N1-391 og P1-126 kortere enn 2,0 Kb. Dermed ble 2 minutter brukt til forlengelsestrinnet. | |||
Tabell 6. Overlapp PCR termosycling program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kjente nukleocapsid-lignende partikkelstrukturene (NCLP) til de ikke-segmenterte negative sansene (NNS) RNA-virusene viser at de monterte NCLPene er de komplekse N med vertscelle-RNAer når de overeksponeres i bakterielle eller eukaryote uttrykkssystemer15,16,17,18,19. Tidligere studier har forsøkt å få RNA gratis N med en rekke metoder, for eksempel RNase A fordøyelse, høy saltvask eller justering av forskjellige pH-buffere for å fjerne de uspesifiserte cellulære RNAene28,29. Imidlertid kan ingen av metodene ovenfor brukes til montering av virusspesifikke NCer. For å oppnå den RNA-frie RSV N, prøvde vi også en kombinasjon av metoder, inkludert RNase A fordøyelse, høy salt (1,5M NaCl) vask, justering av buffer pH fra pH 5,0 til pH 9,0, protein denaturering og renaturering. Etter mange mislykkede forsøk kunne vi fortsatt ikke få RNA-fri N med metodene ovenfor. Vi vil kort diskutere forsøkene og potensielle årsaker.
En metode for å få RNA-fri N er å fordøye vert cellulære RNA i monterte NCLPer med RNase A. I VSV fjernet inkubasjonen av den rensede NCLP med RNase A ved en endelig konsentrasjon på 1mg/ml ved 37 °C i 1 t helt RNA fra NC28. Renset tom oligomerisk N ble deretter inkubert med poly-A (250-nt eller lengre) i et molarforhold på 1:5 i nærvær av RNase-hemmere. Analyse av RNA isolert fra rekonstituert N:poly-A viste at RNA var ca. 90 nt i lengde. Dette antydet at RNA utenfor nukleoproteinet er utsatt for ikke-spesifikk fordøyelse av den forurensede RNase A fra forrige trinn. Strategien til RNase En fordøyelse for å fjerne RNA var ikke vellykket når den ble brukt på RSV. Dette kan skyldes to årsaker. For det første vil forurenset RNase A fordøye den RSV-spesifikke RNA, som senere vil bli inkubert og montert med N. For det andre er effektiviteten til RNase A-fordøyelsen mye lavere i RSV. Dette er fordi RNAene samles annerledes i forskjellige NNS-virus. De kjente krystallstrukturene til N:RNA viser at RNA binder seg utenfor NC i VSV, men inne i NC i RSV30,31. Konfigurasjonen av RNA-binding innover på NC kan føre til lav effektivitet for RNase A å få tilgang til og fordøye.
En annen metode for å få RNA-fri N er å lage avkortingene som kutter både N-terminalmotivet (N-arm) og C-terminalmotivet (C-arm) til N. Imidlertid kan ikke denne avkortede RNA-frie N brukes til å montere med RNA i en stabil NC fordi N-armen til N er brettet inn i sine nærliggende underenheter ved å samhandle med C-terminaldomenet (CTD) til presedens N-underenheten. Den utvidede C-armen er plassert til CTD for neste N-underenhet31.
En ekstra metode for å få RNA-fri N er å forberede mutant N. For eksempel viste resultatet oppnådd av Galloux et al. at RSV RNA-fritt N0P-kompleks kunne oppnås ved samtidig undertrykkelse av en K170A / R185A dobbel N mutant med N-terminus av P i bakterier32. Den har imidlertid to potensielle problemer for ytterligere strukturelle karakteriseringer. Et problem er den lave stabiliteten til dette mutantkomplekset ved høye konsentrasjoner. Det andre problemet er at mutantkomplekset mistet RNA-bindingsevnen, som ikke kan brukes i neste trinn i monteringen.
Til tross for de enorme utfordringene, har vi etablert og optimalisert protokollen for å oppnå virusspesifikke NCer ved hjelp av undertrykkelsen av N med en anstand P. Nylig er en annen vellykket metode å lage en chimeric fusion konstruksjonskoding for P1-50-TEV-N1-405-8xHis for MeV33,34. N0P kan oppnås etter TEV-protease spalting. Renheten til N0P avhenger av effektiviteten til TEV-spaltinger, som kutter den chimeriske fusjonen mellom N- og P-protein.
I stedet for å bruke den chimeriske fusjonsmetoden, designet vi en bi-cistronic coexpression konstruksjon. Spesielt er coexpression konstruksjoner av N0P komplekset designet og konstruert i to åpne leserammer, bestående av hele lengden av N (1-391) med en 10x His-tag på N-terminal i den første ORF, og N-terminal peptider (1-126) fra P i den andre ORF20. Kort sagt er den generelle prosedyren for N0P-rensing å rense His-tagged N0P og N-RNA fra cellulære lysisprøver med koboltperler, fjerne det ikke-spesifikke RNA- og N:cellular RNA-komplekset med Q-kolonne, og få et rent N0P-kompleks med SEC-kolonnen. I SEC-trinnet kan forholdet mellom A260/ A280 overvåkes og dobbeltsjekkes med RNA-ekstraksjon fra N0P-toppfraksjonene.
Samlet sett, i denne protokollen, er de mest kritiske trinnene strategien for å designe byggingen av coexpression av N0P-komplekset og bruke en serieaffinitets- og ionutvekslingskolonne for å skille RNA-fritt N0P-kompleks fra de andre N-cellular RNA-kompleksene. Effektiviteten av coexpression strategien for å få N0P kompleks er relativt lav; rundt 50% N protein er fortsatt N-cellulært RNA-kompleks. Protokollen kan også brukes for å få RNA gratis N0P og montering med spesifikk RNA med N for å få N: RNA kompleks av andre NNS-virus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forskningsprogrammene i Liang-laboratoriet ved Emory støttes av US National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health (NIH) under tildelingsnummer R01GM130950, og Research Start-Up Fund ved Emory University School of Medicine. Forfatteren anerkjenner medlemmene av Liang-laboratoriet for nyttig støtte og kritisk diskusjon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | SIgma | A9539-500G | making construct using LIC method |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC901024 | concentrate the protein sample |
| Ampicillin sodium | GOLD BIOTECHNOLOGY | 5118.111317A | antibiotic for cell culture |
| AseI | NEB | R0526S | making construct using LIC method |
| Cobalt (High Density) Agarose Beads | Gold Bio | H-310-500 | For purification of His-tag protein |
| Corning LSE Digital Dry Bath Heater | CORNING | 6885-DB | Heate the sample |
| dCTP | Invitrogen | 10217016 | making construct using LIC method |
| dGTP | Invitrogen | 10218014 | making construct using LIC method |
| Glycerol | Sigma | G5516-4L | making solution |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | making solution |
| HiTrap Q HP | Sigma | GE29-0513-25 | Protein purification |
| Imidazole | Sigma | I5513-100G | making solution |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) | GOLD BIOTECHNOLOGY | 1116.071717A | induce the expression of protein |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 47730-598 | for PCR |
| Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor | SpectraLab | MSX-XL-2020 | sonicator for lysing cell |
| Negative stain grids | Electron Microscopy Sciences | CF400-Cu-TH | For making negative stain grids |
| New Brunswick Innova 44/44R | eppendorf | M1282-0000 | Shaker for culturing the cell |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385-1L | making solution |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480L | PCR |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | Purify DNA |
| SSPI-HF | NEB | R3132S | making construct using LIC method |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | Sigma | GE29-0915-96 | Protein purification |
| T4 DNA polymerase | Sigma | 70099-3 | making construct using LIC method |
| Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Fisher Scientific | 36-101-0816 | Centrifuge, highest speed 20,000 rpm |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-250G | making solution |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | making negative stain solution |
References
- Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).
- Lamb, R. A. Fields virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. (2013).
- Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease. Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).
- Fearns, R., Deval, J. New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase. Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).
- Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA. Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).
- Pan, J., et al. Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex. Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).
- Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).
- Cao, D., et al. Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase. Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).
- Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).
- Gilman, M. S. A., et al. Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex. Cell. 179 (1), 193-204 (2019).
- Liang, B., et al. Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy. Cell. 162 (2), 314-327 (2015).
- Jenni, S., et al. Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor. Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).
- Renner, M., et al. Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein. Elife. 5, 12627 (2016).
- Cox, R. M., Plemper, R. K. Structure and organization of paramyxovirus particles. Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).
- Desfosses, A., et al. Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape. Nature Communications. 4, 1429 (2013).
- Green, T. J., et al. Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).
- Jamin, M., Yabukarski, F. Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly. Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).
- Wan, W., et al. Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid. Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).
- Mendes, A., Kuhn, R. J. Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly. Viruses. 10 (3), (2018).
- Gao, Y., et al. In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus. Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
- Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
- Green, R., Rogers, E. J. Transformation of chemically competent E. coli. Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).
- De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).
- Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).
- Green, T. J., et al. Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).
- Alvarez Paggi, D., et al. A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model. Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).
- Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex. Science. 313 (5785), 357-360 (2006).
- Tawar, R. G., et al. Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus. Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).
- Galloux, M., et al. Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein. Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).
- Milles, S., et al. Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence. Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).
- Desfosses, A., et al. Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).
