Visualisatie van SARS-CoV-2 met behulp van Immuno RNA-Fluorescentie In Situ Hybridisatie
Summary
Hier beschrijven we een eenvoudige methode die RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (RNA-FISH) combineert met immunofluorescentie om ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA te visualiseren. Dit protocol kan het begrip van de moleculaire kenmerken van SARS-CoV-2 RNA-host interacties op eencellig niveau vergroten.
Abstract
Dit manuscript biedt een protocol voor in situ hybridisatiekettingreactie (HCR) in combinatie met immunofluorescentie om ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA in cellijn en driedimensionale (3D) culturen van menselijk luchtwegepitheel te visualiseren. De methode maakt zeer specifieke en gevoelige visualisatie van viraal RNA mogelijk door te vertrouwen op HCR geïnitieerd door sondelokalisatie. Split-initiator sondes helpen het signaal te versterken door fluorescentie gelabelde versterkers, wat resulteert in verwaarloosbare achtergrondfluorescentie in confocale microscopie. Het labelen van versterkers met verschillende fluorescerende kleurstoffen vergemakkelijkt de gelijktijdige herkenning van verschillende doelen. Dit maakt het op zijn beurt mogelijk om de infectie in weefsels in kaart te brengen om virale pathogenese en replicatie op het niveau van één cel beter te begrijpen. Het koppelen van deze methode aan immunofluorescentie kan een beter begrip van gastheer-virusinteracties vergemakkelijken, inclusief afwisseling van het gastheerepidogeen en immuunresponsroutes. Dankzij gevoelige en specifieke HCR-technologie kan dit protocol ook als diagnostisch hulpmiddel worden gebruikt. Het is ook belangrijk om te onthouden dat de techniek gemakkelijk kan worden gewijzigd om detectie van RNA mogelijk te maken, inclusief niet-coderende RNA’s en RNA-virussen die in de toekomst kunnen ontstaan.
Introduction
SARS-CoV-2 is een nieuw humaan betacoronavirus dat eind 2019 opkwam en een paar maanden later een ongekende pandemie veroorzaakte. Omdat het virus nieuw is voor de wetenschap, blijven veel van de biologie en de impact ervan op gastheercellen onbekend. Daarom is het in kaart brengen van het viruscel- en -weefseltropisme tijdens infectie belangrijk om de biologische basiskenmerken en de effecten ervan op de gastheer te begrijpen. Verschillende technieken worden gebruikt om virus-gastheer samenspel te onderzoeken, waaronder biochemische, biologische en fysieke assays. In situ hybridisatie is een veelgebruikte methode die gebruik maakt van gelabeld complementair DNA, RNA of gemodificeerde nucleïnezuursondes, die lokaliseren naar specifieke DNA- of RNA-sequenties in een cel of weefsel.
Er is een nieuwe RNA fluorescente in situ hybridisatiemethode (RNA-FISH) ontwikkeld die wijzigingen bevat om de gevoeligheid te verhogen door de signaal-ruisverhouding te versterken via een HCR1. HCR maakt de studie van RNA-lokalisatie op een eencellig niveau mogelijk. Vanwege de hoge specificiteit, gevoeligheid en resolutie is deze methode niet alleen nuttig voor basiswetenschappelijke studies, maar ook voor toepassingsprojecten, bijvoorbeeld diagnostiek. Onlangs werd de haalbaarheid van deze methode aangetoond voor het detecteren van SARS-CoV-2 RNA gelokaliseerd in ciliated cellen binnen volledig gedifferentieerde 3D menselijke luchtwegepitheel (HAE) culturen2. HAE-culturen vormen een van de meest geavanceerde instrumenten die worden gebruikt om virale infectie te bestuderen in de context van het micromilieu “natuurlijke infectie”3,4.
Verschillende rapporten over menselijke coronavirussen (HCoV), waaronder SARS-CoV-2, benadrukken het belang van epigenetische modificaties met betrekking tot HCoV-infectie en pathofysiologie [herzien in 5], bijvoorbeeld het methylatiepatroon van het gen dat codeert voor de angiotensine-converterende enzym 2 (ACE-2) receptor6,7. Interessant is dat massaspectrometrische screening verschillende epigenetische factoren identificeerde die interageren met het SARS-CoV-2 proteoom8. Meer specifiek bindt niet-structureel eiwit 5 (NSP5) zich aan de epigenetische regulator, histondeacetylase 2 en de katalytisch inactieve NSP5 (C145A) interageert met tRNA methyltransferase 1 (24). Bovendien wordt de NSP16-methyltransferaseactiviteit geblokkeerd door de methyltransferaseremmer, sinefungin9. De exacte rol van deze epigenetische factoren bij COVID-19 blijft echter onduidelijk. Replicatie van HCoV vindt plaats in het cytoplasma van de geïnfecteerde cel en veroorzaakt ontstekingsreacties die worden gereguleerd door epigenetische modificaties10.
Bijvoorbeeld, HCoV-229E fine-tunes nucleaire factor-kappa B signalering en herprogrammeert diep het gastheer cellulaire chromatine landschap door het verhogen van acetylatie van H3K36 en H4K5 in bepaalde regio’s11. De infectie met het midden-oosten respiratoire syndroom verhoogt de niveaus van H3K27me3 en put H3K4me3 uit in de promotorregio’s van subsets van specifieke interferongevoelige genen12. Bovendien activeert viraal RNA celimmuunreacties, zoals aangetoond voor flavivirussen13, retrovirussen14,15en coronavirussen16. De epigenetische markers op viraal RNA kunnen een rol spelen bij de herkenning door cellulaire sensoren, zoals aangetoond voor m7A methylatie van humaan immunodeficiëntievirus-1 RNA17. Er blijven echter vragen over: Wat is de impact van SARS-CoV-2 RNA op de immuunrespons en zijn epigenetische tekens betrokken?
Hier is een geoptimaliseerde RNA-FISH-methode beschreven in combinatie met immunofluorescentieanalyse van cellijnen en 3D-weefsels (volledig gedifferentieerde HAE). Hoewel cytologische methoden, zoals FISH en immunofluorescentie, op grote schaal worden gebruikt, is deze nieuwe generatie in situ hybridisatiemethode op basis van HCR nooit gebruikt voor virusdetectie (behalve in een recente publicatie)2. Over het algemeen vereisen immunostaining en FISH de volgende stappen: permeabilisatie om penetratie van sondes of antilichamen mogelijk te maken; fixatie waarbij cellulair materiaal wordt gefixeerd en bewaard; detectie waarbij antilichamen of nucleïnezuursondes worden toegepast; en ten slotte, montage van de monsters voor visualisatie.
Hoewel bestaande protocollen deze algemene kenmerken delen, variëren ze aanzienlijk met betrekking tot de betrokken parameters. Hier is een geoptimaliseerd, eenvoudig, immuno-RNA-FISH protocol beschreven om SARS-CoV-2 RNA te detecteren in HAE-culturen en Vero-cellen. De techniek bestaat uit de volgende stappen: (1) fixatie van cellen met paraformaldehyde; (2) permeabilisatie met detergent of methanol (MeOH); (3) rehydratatie door middel van een reeks MeOH-oplossingen (alleen HAE-culturen); 4. detectie; (5) versterking met behulp van HCR-technologie om SARS-CoV-2 RNA te detecteren; 6. immunostaining; en (7) beeldvorming onder een confocale microscoop.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immuno-RNA-FISH is een betrouwbare methode voor dubbele kleuring van RNA en cellulaire eiwitten. Hier is een aangepast immuno-RNA-FISH protocol beschreven dat detectie van SARS-CoV-2 RNA en cellulaire eiwitten in cellijnen en HAE-culturen mogelijk maakt. Dit protocol kan worden aangepast voor gebruik in verschillende celmodellen, waaronder celmonolagen of specifieke weefsels. De methode is gebaseerd op het concept van een HCR die is geïnitieerd door de juiste sondelokalisatie. Vervolgens resulteert het gebruik van split…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en Hoger Onderwijs voor onderzoek naar SARS-CoV-2, en door subsidies van het National Science Center (subsidies UMO2017/27/B/NZ6/02488 aan K.P. en UMO-2018/30/E/NZ1/00874 aan A.K.-P.).
Materials
| Equipment | |||
| Confocal Microscope LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, Mini Rocker- Shaker | Fisher Scientific | 12965501 | |
| Incubator Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| Materials | |||
| 15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips | LabSolute | 7695022 | |
| 1.5 mL tubes | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| 12-well plate | TTP | 92412 | |
| Conical centrifuge tube | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| serological pipets | VWR Collection | 612-5523P, 612-5827P | |
| slide glass | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
| Reagents | |||
| Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies | Invitrogen | ||
| β5-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| Disodium phosphate | Sigma | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR Amplification Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S013922 | |
| HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S012522 | |
| HCR Probe Hybridization Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| HCR Probe Wash Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methanol | Sigma | 32213-1L-M | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655-100G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| PIPES | BioShop | PIP666.100 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P5405-250G | |
| Prolong Diamond Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36970 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.5 | |
| Trisodium Citrate 2-hydrate | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| Software | |||
| Fluorescence Spectraviewer | Modeling spectral parameters | ||
| ImageJ Fiji | Acquiring and processing z-stack images |
References
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
- Milewska, A., et al. Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium. Journal of Virology. 94, (2020).
- Banach, B. S., et al. Human airway epithelial cell culture to identify new respiratory viruses: coronavirus NL63 as a model. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 19-26 (2009).
- Milewska, A., et al. Entry of human coronavirus NL63 into the cell. Journal of Virology. 92, (2018).
- El Baba, R., Herbein, G. Management of epigenomic networks entailed in coronavirus infections and COVID-19. Clinical Epigenetics. 12, 118 (2020).
- Pinto, B. G. G., et al. ACE2 expression is increased in the lungs of patients with comorbidities associated with severe COVID-19. Journal of Infectious Diseases. 222 (4), 556-563 (2020).
- Verdecchia, P., Cavallini, C., Spanevello, A., Angeli, F. The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-CoV-2 infection. European Journal of Internal Medicine. 76, 14-20 (2020).
- Gordon, D. E., et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature. 583, 459-468 (2020).
- Ferron, F., Decroly, E., Selisko, B., Canard, B. The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs. Antiviral Research. 96 (1), 21-31 (2012).
- Mehta, S., Jeffrey, K. L. Beyond receptors and signaling: epigenetic factors in the regulation of innate immunity. Immunology and Cell Biology. 93 (3), 233-244 (2015).
- Poppe, M., et al. The NF-kappaB-dependent and -independent transcriptome and chromatin landscapes of human coronavirus 229E-infected cells. PLoS Pathogens. 13, 1006286 (2017).
- Schafer, A., Baric, R. S. Epigenetic landscape during coronavirus infection. Pathogens. 6 (1), 8 (2017).
- Carletti, T., et al. Viral priming of cell intrinsic innate antiviral signaling by the unfolded protein response. Nature Communications. 10, 3889 (2019).
- Heil, F., et al. Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science. 303 (5663), 1526-1529 (2004).
- Sze, A., et al. Host restriction factor SAMHD1 limits human T cell leukemia virus type 1 infection of monocytes via STING-mediated apoptosis. Cell Host and Microbe. 14 (4), 422-434 (2013).
- Kikkert, M. Innate immune evasion by human respiratory RNA viruses. Journal of Innate Immunity. 12, 4-20 (2020).
- Kennedy, E. M., et al. Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression. Cell Host and Microbe. 22 (6), 830 (2017).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
- Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. Visualizing coronavirus entry into cells. Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).
