הדמיה של SARS-CoV-2 באמצעות אימונו RNA-פלואורסצנטיות בהכלאה Situ
Summary
כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה המשלבת פלואורסצנטיות RNA בהכלאה במקום (RNA-FISH) עם כשל חיסוני כדי לדמיין תסמונת נשימתית חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2) RNA. פרוטוקול זה עשוי להגביר את ההבנה של המאפיינים המולקולריים של אינטראקציות מארח SARS-CoV-2 RNA ברמת תא יחיד.
Abstract
כתב יד זה מספק פרוטוקול לתגובת שרשרת הכלאה (HCR) בשילוב עם כשל חיסוני כדי לדמיין תסמונת נשימתית חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2) RNA בקו התא ותרביות תלת מימדיות (3D) של אפיתל דרכי הנשימה האנושיות. השיטה מאפשרת הדמיה ספציפית ורגישה מאוד של RNA ויראלי על ידי הסתמכות על HCR ביוזמת לוקליזציה בדיקה. בדיקות של יוזם פיצול מסייעות להגביר את האות על-ידי מגברים בעלי תווית פלואורסצנטית, וכתוצאה מכך פלואורסצנטיות רקע זניחה במיקרוסקופיה קונפוקלית. תיוג מגברים עם צבעים פלואורסצנטיים שונים מקל על זיהוי בו זמנית של מטרות שונות. זה, בתורו, מאפשר את המיפוי של הזיהום ברקמות כדי להבין טוב יותר פתוגנזה ויראלית ושכפול ברמת תא יחיד. צימוד שיטה זו עם כשל חיסוני עשוי להקל על הבנה טובה יותר של אינטראקציות בין וירוסים מארחים, כולל החלפה של האפיגנום המארח ומסלולי התגובה החיסונית. בשל טכנולוגיית HCR רגישה וספציפית, פרוטוקול זה יכול לשמש גם ככלי אבחון. חשוב גם לזכור כי הטכניקה עשויה להשתנות בקלות כדי לאפשר זיהוי של כל RNA, כולל RNAs שאינם קידוד וירוסים RNA שעשויים לצוץ בעתיד.
Introduction
SARS-CoV-2 הוא נגיף בטאקורונה אנושי חדש שהתגלה בסוף 2019, וגרם למגפה חסרת תקדים כמה חודשים לאחר מכן. מכיוון שהנגיף חדש למדע, חלק גדול מהביולוגיה שלו והשפעתו על תאים מארחים עדיין לא ידועים. לכן, מיפוי הנגיף-תא ו -רקמה טרופיזם במהלך ההדבקה חשוב אם המאפיינים הביולוגיים הבסיסיים שלה ואת השפעותיו על המארח הם להיות מובנים. מספר טכניקות משמשות לבחינת יחסי הגומלין בין מארחי וירוסים, כולל מבחנים ביוכימיים, ביולוגיים ופיזיים. באתרו הכלאה היא שיטה נפוצה המעסיקה DNA משלים, RNA, או בדיקות חומצת גרעין שונה, אשר לוקליזציה לרצפי DNA או RNA ספציפיים בתא או ברקמה.
פותח פלואורסצנט RNA חדש בשיטת ההכלאה (RNA-FISH) המשלבת שינויים להגברת הרגישות על ידי הגברת יחס האות לרעש באמצעות HCR1. HCR מאפשר את המחקר של לוקליזציה RNA ברמת תא יחיד. בשל הספציפיות הגבוהה שלה, רגישות, ורזולוציה, שיטה זו שימושית לא רק עבור לימודי מדע בסיסיים, אלא גם עבור פרויקטים אפליקטורטיביים, למשל, אבחון. לאחרונה, ההיתכנות של שיטה זו הודגמה לגילוי SARS-CoV-2 RNA מקומי לתאים ciliated בתוך אפיתל דרכי הנשימה האנושי מובחן לחלוטין (HAE)תרבויות 2. תרבויות HAE מהוות את אחד הכלים המתקדמים ביותר המשמשים לחקר זיהום ויראלי בהקשר של “זיהום טבעי” microenvironment3,4.
מספר דיווחים על נגיפי קורונה אנושיים (HCoV), כולל SARS-CoV-2, מדגישים את החשיבות של שינויים אפיגנטיים ביחס לזיהום HCoV ופתופיזיולוגיה [נבדק ב 5],למשל, דפוס המתילציה של הגן המקודד את האנזים הממיר אנגיוטנסין 2 (ACE-2) קולטן6,7. מעניין, הקרנה ספקטרומטרית המונית זיהתה מספר גורמים אפיגנטיים המקיימים אינטראקציה עם פרוטאום SARS-CoV-28. ליתר דיוק, חלבון לא מבני 5 (NSP5) נקשר לווסת האפיגנטי, היסטון דיאצטילאז 2, וה- NSP5 (C145A) הלא פעיל באופן קטליטי מקיים אינטראקציה עם tRNA מתילטרנספראז 1 (24). בנוסף, פעילות מתיל-טרנספראז NSP16 נחסמת על ידי מעכב המתיל-טרנספראז, סינאפונגין9. עם זאת, התפקיד המדויק של גורמים אפיגנטיים אלה ב- COVID-19 עדיין לא ברור. שכפול של HCoV מתרחש בציטופלסמה של התא הנגוע, ומפעיל תגובות דלקתיות המווסתות על ידי שינויים אפיגנטיים10.
לדוגמה, HCoV-229E מכוונן עדין גורם גרעיני-קאפה B איתות ומתכנת מחדש עמוקות את הנוף כרומטין הסלולר המארח על ידי הגדלת אצטילציה של H3K36 ו H4K5 באזורים מסוימים11. זיהום בנגיף הקורונה הקשור לתסמונת הנשימה במזרח התיכון מגביר את רמות H3K27me3 ומרוקן את H3K4me3 באזורי היזמים של תת-קבוצות של גנים ספציפיים הרגישים לאינטרפרון12. בנוסף, RNA ויראלי מפעיל תגובות חיסוניות של התאים, כפי שהוכח עבור flaviviruses13, retroviruses14,15, ו Coronaviruses16. סמנים אפיגנטיים על RNA ויראלי עשוי לשחק תפקיד בזיהוי על ידי חיישנים סלולריים, כפי שמוצג עבור מתילציה m7A של וירוס כשל חיסוני אנושי-1 RNA17. עם זאת, שאלות נשארות: מהי ההשפעה של SARS-CoV-2 RNA על התגובה החיסונית, והאם סימנים אפיגנטיים מעורבים?
כאן תוארה שיטת RNA-FISH ממוטבת בשילוב עם ניתוח כשל חיסוני של קווי תאים ורקמות תלת-ממדיות (HAE מובחן לחלוטין). למרות שיטות ציטולוגיות, כגון FISH ו immunofluorescence, נמצאים בשימוש נרחב, זה דור חדש בשיטת הכלאה situ המבוסס על HCR מעולם לא שימש לגילוי וירוסים (למעט בפרסום האחרון)2. באופן כללי, immunostaining ו- FISH דורשים את השלבים הבאים: חדירה כדי לאפשר חדירה של בדיקות או נוגדנים; קיבוע שבו חומר סלולרי קבוע ומשומר; גילוי שבו נוגדנים או בדיקות חומצת גרעין מוחלים; ולבסוף, הרכבה של הדגימות להדמיה.
למרות שפרוטוקולים קיימים חולקים תכונות כלליות אלה, הם משתנים במידה ניכרת ביחס לפרמטרים המעורבים. כאן, פרוטוקול אופטימיזציה, פשוט, אימונו-RNA-FISH תואר כדי לזהות SARS-CoV-2 RNA בתרבויות HAE ותאי ורו. הטכניקה כוללת את השלבים הבאים: (1) קיבוע של תאים עם paraformaldehyde; (2) חדירה עם חומר ניקוי או מתנול (MeOH); (3) התייבשות באמצעות סדרה מדורגת של פתרונות MeOH (תרבויות HAE בלבד); (4) איתור; (5) הגברה באמצעות טכנולוגיית HCR כדי לזהות SARS-CoV-2 RNA; (6) חיסון; ו-(7) הדמיה תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי.
Protocol
Representative Results
Discussion
אימונו-רנ”א-פיש היא שיטה אמינה לכתמים כפולים של רנ”א וחלבונים תאיים. כאן, פרוטוקול חיסוני-RNA-FISH שונה תואר המאפשר זיהוי של SARS-CoV-2 RNA וחלבונים תאיים בקווי תאים ותרבויות HAE. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשימוש במודלים שונים של תאים, כולל monolayers תאים או רקמות ספציפיות. השיטה מסתמכת על הרעיון של HCR ב?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע וההשכלה הגבוהה למחקר על SARS-CoV-2, ועל ידי מענקים מהמרכז הלאומי למדע (מענקים UMO2017/27/B/NZ6/02488 ל- K.P. ו- UMO-2018/30/E/NZ1/00874 ל- A.K.-P.).
Materials
| Equipment | |||
| Confocal Microscope LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, Mini Rocker- Shaker | Fisher Scientific | 12965501 | |
| Incubator Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| Materials | |||
| 15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips | LabSolute | 7695022 | |
| 1.5 mL tubes | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| 12-well plate | TTP | 92412 | |
| Conical centrifuge tube | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| serological pipets | VWR Collection | 612-5523P, 612-5827P | |
| slide glass | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
| Reagents | |||
| Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies | Invitrogen | ||
| β5-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| Disodium phosphate | Sigma | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR Amplification Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S013922 | |
| HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S012522 | |
| HCR Probe Hybridization Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| HCR Probe Wash Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methanol | Sigma | 32213-1L-M | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655-100G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| PIPES | BioShop | PIP666.100 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P5405-250G | |
| Prolong Diamond Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36970 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.5 | |
| Trisodium Citrate 2-hydrate | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| Software | |||
| Fluorescence Spectraviewer | Modeling spectral parameters | ||
| ImageJ Fiji | Acquiring and processing z-stack images |
References
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
- Milewska, A., et al. Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium. Journal of Virology. 94, (2020).
- Banach, B. S., et al. Human airway epithelial cell culture to identify new respiratory viruses: coronavirus NL63 as a model. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 19-26 (2009).
- Milewska, A., et al. Entry of human coronavirus NL63 into the cell. Journal of Virology. 92, (2018).
- El Baba, R., Herbein, G. Management of epigenomic networks entailed in coronavirus infections and COVID-19. Clinical Epigenetics. 12, 118 (2020).
- Pinto, B. G. G., et al. ACE2 expression is increased in the lungs of patients with comorbidities associated with severe COVID-19. Journal of Infectious Diseases. 222 (4), 556-563 (2020).
- Verdecchia, P., Cavallini, C., Spanevello, A., Angeli, F. The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-CoV-2 infection. European Journal of Internal Medicine. 76, 14-20 (2020).
- Gordon, D. E., et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature. 583, 459-468 (2020).
- Ferron, F., Decroly, E., Selisko, B., Canard, B. The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs. Antiviral Research. 96 (1), 21-31 (2012).
- Mehta, S., Jeffrey, K. L. Beyond receptors and signaling: epigenetic factors in the regulation of innate immunity. Immunology and Cell Biology. 93 (3), 233-244 (2015).
- Poppe, M., et al. The NF-kappaB-dependent and -independent transcriptome and chromatin landscapes of human coronavirus 229E-infected cells. PLoS Pathogens. 13, 1006286 (2017).
- Schafer, A., Baric, R. S. Epigenetic landscape during coronavirus infection. Pathogens. 6 (1), 8 (2017).
- Carletti, T., et al. Viral priming of cell intrinsic innate antiviral signaling by the unfolded protein response. Nature Communications. 10, 3889 (2019).
- Heil, F., et al. Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science. 303 (5663), 1526-1529 (2004).
- Sze, A., et al. Host restriction factor SAMHD1 limits human T cell leukemia virus type 1 infection of monocytes via STING-mediated apoptosis. Cell Host and Microbe. 14 (4), 422-434 (2013).
- Kikkert, M. Innate immune evasion by human respiratory RNA viruses. Journal of Innate Immunity. 12, 4-20 (2020).
- Kennedy, E. M., et al. Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression. Cell Host and Microbe. 22 (6), 830 (2017).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
- Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. Visualizing coronavirus entry into cells. Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).
