Visualização de SARS-CoV-2 usando Imuno RNA-Fluorescence In Situ Hibridização
Summary
Aqui, descrevemos um método simples que combina fluorescência de RNA na hibridização situ (RNA-FISH) com imunofluorescência para visualizar síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) RNA. Este protocolo pode aumentar a compreensão das características moleculares das interações sars-cov-2 RNA-host em um nível de célula única.
Abstract
Este manuscrito fornece um protocolo para reação em cadeia de hibridização in situ (HCR) juntamente com a imunofluorescência para visualizar a síndrome respiratória aguda grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA na linha celular e culturas tridimensionais (3D) do epitélio das vias aéreas humanas. O método permite uma visualização altamente específica e sensível do RNA viral, contando com o HCR iniciado pela localização da sonda. As sondas de iniciação dividida ajudam a amplificar o sinal por amplificadores fluorescentes rotulados, resultando em fluorescência de fundo insignificante na microscopia confocal. A rotulagem de amplificadores com diferentes corantes fluorescentes facilita o reconhecimento simultâneo de vários alvos. Isso, por sua vez, permite o mapeamento da infecção nos tecidos para entender melhor a patogênese viral e a replicação no nível unicelular. Acoplamento deste método com imunofluorescência pode facilitar uma melhor compreensão das interações hospedeiro-vírus, incluindo a alternância das vias de epigenome hospedeiro e resposta imune. Devido à tecnologia de HCR sensível e específica, este protocolo também pode ser usado como uma ferramenta de diagnóstico. Também é importante lembrar que a técnica pode ser modificada facilmente para permitir a detecção de qualquer RNA, incluindo RNAs não codificadas e vírus RNA que possam surgir no futuro.
Introduction
SARS-CoV-2 é um novo betacoronavírus humano que surgiu no final de 2019, causando uma pandemia sem precedentes alguns meses depois. Como o vírus é novo na ciência, grande parte de sua biologia e seu impacto nas células hospedeiras permanecem desconhecidos. Portanto, mapear o tropismo de células vírus e tecidos durante a infecção é importante para que suas características biológicas básicas e seus efeitos sobre o hospedeiro sejam compreendidos. Várias técnicas são usadas para examinar a interação entre vírus, incluindo ensaios bioquímicos, biológicos e físicos. A hibridização in situ é um método comum que emprega dna complementar rotulado, RNA ou sondas de ácido nucleico modificado, que se localizam para sequências específicas de DNA ou RNA em uma célula ou tecido.
Foi desenvolvido um novo método de hibridização fluorescente de RNA (RNA-FISH) que incorpora modificações para aumentar a sensibilidade, amplificando a relação sinal-ruído através de um HCR1. O HCR permite o estudo da localização do RNA em um nível unicelular. Devido à sua alta especificidade, sensibilidade e resolução, este método é útil não apenas para estudos científicos básicos, mas também para projetos aplicativos, por exemplo, diagnósticos. Recentemente, foi demonstrada a viabilidade desse método para a detecção do RNA SARS-CoV-2 localizado em células ciliadas dentro de culturas de epitélio 3D (HAE) totalmente diferenciadas3D. As culturas hae constituem uma das ferramentas mais avançadas utilizadas para estudar a infecção viral no contexto do microambiente “infecção natural”3,4.
Vários relatórios sobre coronavírus humanos (HCoV), incluindo SARS-CoV-2, destacam a importância de modificações epigenéticas em relação à infecção por HCoV e à fisiopatologia [revisada em 5],por exemplo, o padrão de metilação do gene codificando o receptor de enzima conversor de angiotensina 2 (ACE-2)receptor 6,7. Curiosamente, a triagem em massa-espectrométrica identificou vários fatores epigenéticos que interagem com o proteome SARS-CoV-28. Mais especificamente, a proteína não estrutural 5 (NSP5) se liga ao regulador epigenético, histona deacetillase 2, e o catalítico inativo NSP5 (C145A) interage com o tRNA metiltransferase 1 (24). Além disso, a atividade de metiltransferase NSP16 é bloqueada pelo inibidor de metiltransferase, sinefungin9. No entanto, o papel exato desses fatores epigenéticos no COVID-19 ainda não está claro. A replicação do HCoV ocorre no citoplasma da célula infectada, e desencadeia respostas inflamatórias que são reguladas por modificações epigenéticas10.
Por exemplo, hCoV-229E afina a sinalização fator nuclear-kappa B e reprograma profundamente a paisagem de cromatina celular hospedeira aumentando a acetilação de H3K36 e H4K5 em certas regiões11. A infecção por coronavírus relacionada à síndrome respiratória do Oriente Médio aumenta os níveis de H3K27me3 e esgota o H3K4me3 nas regiões promotoras de subconjuntos de genes sensíveis a interferon específicos12. Além disso, o RNA viral desencadeia respostas imunes celulares, como demonstrado para os flavivírus13, retrovírus14,15e coronavírus16. Os marcadores epigenéticos no RNA viral podem desempenhar um papel no reconhecimento pelos sensores celulares, como mostrado para a metilação m7A do vírus da imunodeficiência humana-1 RNA17. No entanto, permanecem as perguntas: Qual é o impacto do RNA SARS-CoV-2 na resposta imune, e são marcas epigenéticas envolvidas?
Aqui, foi descrito um método RNA-FISH otimizado, juntamente com a análise de imunofluorescência de linhas celulares e tecidos 3D (HAE totalmente diferenciado). Embora métodos citológicos, como FISH e imunofluorescência, sejam amplamente utilizados, este método de hibridização in situ de nova geração baseado no HCR nunca foi utilizado para detecção de vírus (exceto em uma publicação recente)2. Em geral, imunostenções e PEIXEs requerem as seguintes etapas: permeabilização para permitir a penetração de sondas ou anticorpos; fixação em que o material celular é fixo e preservado; detecção em que anticorpos ou sondas de ácido nucleico são aplicadas; e, finalmente, montagem das amostras para visualização.
Embora os protocolos existentes compartilhem essas características gerais, elas variam significativamente em relação aos parâmetros envolvidos. Aqui, um protocolo otimizado, simples e imuno-RNA-FISH foi descrito para detectar RNA SARS-CoV-2 em culturas HAE e células Vero. A técnica compreende as seguintes etapas: (1) fixação de células com paraformaldeído; (2) permeabilização com detergente ou metanol (MeOH); (3) reidratação através de uma série classificada de soluções MeOH (apenas culturas HAE); (4) detecção; (5) amplificação utilizando a tecnologia HCR para detectar RNA SARS-CoV-2; (6) imunostaining; e (7) imagens sob um microscópio confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
O Imuno-RNA-FISH é um método confiável para coloração dupla de RNA e proteínas celulares. Aqui, foi descrito um protocolo modificado de imuno-RNA-FISH que permite a detecção de RNA SARS-CoV-2 e proteínas celulares em linhas celulares e culturas HAE. Este protocolo pode ser adaptado para uso em diferentes modelos celulares, incluindo monocamadas celulares ou tecidos específicos. O método se baseia no conceito de um HCR iniciado pela localização adequada da sonda. Em seguida, o uso de sondas de iniciação div…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Ciência e Educação Superior para pesquisa sobre SARS-CoV-2, e por bolsas do Centro Nacional de Ciência (bolsas UMO2017/27/B/NZ6/02488 a K.P. e UMO-2018/30/E/NZ1/00874 a A.K.-P.).
Materials
| Equipment | |||
| Confocal Microscope LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, Mini Rocker- Shaker | Fisher Scientific | 12965501 | |
| Incubator Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| Materials | |||
| 15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips | LabSolute | 7695022 | |
| 1.5 mL tubes | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| 12-well plate | TTP | 92412 | |
| Conical centrifuge tube | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| serological pipets | VWR Collection | 612-5523P, 612-5827P | |
| slide glass | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
| Reagents | |||
| Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies | Invitrogen | ||
| β5-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| Disodium phosphate | Sigma | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR Amplification Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S013922 | |
| HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S012522 | |
| HCR Probe Hybridization Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| HCR Probe Wash Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methanol | Sigma | 32213-1L-M | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655-100G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| PIPES | BioShop | PIP666.100 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P5405-250G | |
| Prolong Diamond Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36970 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.5 | |
| Trisodium Citrate 2-hydrate | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| Software | |||
| Fluorescence Spectraviewer | Modeling spectral parameters | ||
| ImageJ Fiji | Acquiring and processing z-stack images |
References
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