Visualisering av SARS-CoV-2 ved hjelp av Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization
Summary
Her beskriver vi en enkel metode som kombinerer RNA fluorescens in situ hybridisering (RNA-FISH) med immunfluorescens for å visualisere alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA. Denne protokollen kan øke forståelsen av de molekylære egenskapene til SARS-CoV-2 RNA-vert interaksjoner på et enkeltcellet nivå.
Abstract
Dette manuskriptet gir en protokoll for in situ hybridiseringskjedereaksjon (HCR) kombinert med immunfluorescens for å visualisere alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA i cellelinje og tredimensjonale (3D) kulturer av menneskelig luftveisepiteli. Metoden tillater svært spesifikk og sensitiv visualisering av viral RNA ved å stole på HCR initiert av sondelokalisering. Split-initiator sonder bidrar til å forsterke signalet av fluorescerende merkede forsterkere, noe som resulterer i ubetydelig bakgrunnsfluorescens i konfektmikroskopi. Merking av forsterkere med forskjellige fluorescerende fargestoffer letter samtidig anerkjennelse av ulike mål. Dette gjør det igjen mulig å kartlegge infeksjonen i vev for bedre å forstå viral patogenese og replikasjon på encellet nivå. Kobling av denne metoden med immunfluorescens kan lette bedre forståelse av vert-virus interaksjoner, inkludert veksling av verten epigenom og immunrespons veier. På grunn av sensitiv og spesifikk HCR-teknologi kan denne protokollen også brukes som et diagnostisk verktøy. Det er også viktig å huske at teknikken lett kan endres for å muliggjøre deteksjon av RNA, inkludert ikke-kodende RNAer og RNA-virus som kan dukke opp i fremtiden.
Introduction
SARS-CoV-2 er et nytt humant betacoronavirus som dukket opp i slutten av 2019, noe som førte til en enestående pandemi noen måneder senere. Fordi viruset er nytt for vitenskapen, forblir mye av biologien og dens innvirkning på vertsceller ukjent. Derfor er kartlegging av viruscelle- og vevtropismen under infeksjon viktig hvis dens grunnleggende biologiske egenskaper og dens effekter på verten skal forstås. Flere teknikker brukes til å undersøke virus-vert samspill inkludert biokjemiske, biologiske og fysiske analyser. In situ hybridisering er en vanlig metode som bruker merket komplementært DNA, RNA eller modifiserte nukleinsyresonder, som lokaliserer til spesifikke DNA- eller RNA-sekvenser i en celle eller et vev.
En ny RNA fluorescerende in situ hybridisering (RNA-FISH) metode er utviklet som inkorporerer modifikasjoner for å øke følsomheten ved å forsterke signal-til-støy-forholdet via en HCR1. HCR tillater studiet av RNA lokalisering på et enkeltcellet nivå. På grunn av sin høye spesifisitet, følsomhet og oppløsning er denne metoden nyttig ikke bare for grunnleggende vitenskapsstudier, men også for applikatoriske prosjekter, for eksempel diagnostikk. Nylig ble muligheten for denne metoden demonstrert for å oppdage SARS-CoV-2 RNA lokalisert til ciliated celler innenfor fullt differensierte 3D human airway epitel (HAE) kulturer2. HAE-kulturer utgjør et av de mest avanserte verktøyene som brukes til å studere virusinfeksjon i sammenheng med “naturlig infeksjon” mikromiljøet3,4.
Flere rapporter om humane koronavirus (HCoV), inkludert SARS-CoV-2, fremhever viktigheten av epigenetiske modifikasjoner med hensyn til HCoV-infeksjon og patofysiologi [gjennomgått i 5], for eksempel metyleringsmønsteret til genet som koder angiotensinkonverterende enzym 2 (ACE-2)reseptor 6,7. Interessant nok identifiserte massespektrometrisk screening flere epigenetiske faktorer som samhandler med SARS-CoV-2 proteom8. Mer spesifikt binder ikke-strukturelt protein 5 (NSP5) seg til den epigenetiske regulatoren, histondeacetylase 2 og den katalytisk inaktive NSP5 (C145A) samhandler med tRNA metyltransferase 1 (24). I tillegg er NSP16 metyltransferaseaktivitet blokkert av metyltransferasehemmeren, sinfungin9. Imidlertid er den eksakte rollen til disse epigenetiske faktorene i COVID-19 fortsatt uklar. Replikasjon av HCoV foregår i cytoplasma av den infiserte cellen, og utløser inflammatoriske responser som reguleres av epigenetiske modifikasjoner10.
For eksempel, HCoV-229E fine-tunes kjernefysisk faktor-kappa B signalering og dypt omprogrammerer verten cellulært kromatin landskap ved å øke acetylering av H3K36 og H4K5 i visse regioner11. Midtøsten respiratorisk syndrom-relatert coronavirus infeksjon øker nivåene av H3K27me3 og tømmer H3K4me3 på promotorregioner av undergrupper av spesifikke interferon-sensitive gener12. I tillegg utløser virale RNA celleimmuneresponser, som vist for flavivirus13, retrovirus14,15og koronavirus16. De epigenetiske markørene på viral RNA kan spille en rolle i anerkjennelse av cellulære sensorer, som vist for m7A metylering av human immunsviktvirus-1 RNA17. Spørsmålene gjenstår imidlertid: Hva er virkningen av SARS-CoV-2 RNA på immunresponsen, og er epigenetiske merker involvert?
Her er en optimalisert RNA-FISH-metode kombinert med immunfluorescensanalyse av cellelinjer og 3D-vev (fullt differensiert HAE) beskrevet. Selv om cytologiske metoder, som FISK og immunfluorescens, brukes mye, har denne nye generasjonen in situ hybridiseringsmetode basert på HCR aldri blitt brukt til virusdeteksjon (unntatt i en nylig publikasjon)2. Generelt krever immunoppfatning og FISK følgende trinn: permeabilisering for å muliggjøre penetrasjon av sonder eller antistoffer; fiksering der cellulært materiale er festet og bevart; deteksjon der antistoffer eller nukleinsyresonder påføres; og til slutt montering av prøvene for visualisering.
Selv om eksisterende protokoller deler disse generelle funksjonene, varierer de markant med hensyn til de involverte parameterne. Her er en optimalisert, enkel, immuno-RNA-FISH-protokoll beskrevet for å oppdage SARS-CoV-2 RNA i HAE-kulturer og Vero-celler. Teknikken består av følgende trinn: (1) fiksering av celler med paraformaldehyd; (2) permeabilisering med vaskemiddel eller metanol (MeOH); (3) rehydrering gjennom en gradert serie MeOH-løsninger (kun HAE-kulturer); (4) deteksjon; (5) forsterkning ved hjelp av HCR-teknologi for å oppdage SARS-CoV-2 RNA; (6) immunstaining; og (7) avbildning under et konfokalt mikroskop.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immuno-RNA-FISH er en pålitelig metode for dobbeltfarging av RNA og cellulære proteiner. Her er det beskrevet en modifisert immuno-RNA-FISH-protokoll som gjør det mulig å oppdage SARS-CoV-2 RNA og cellulære proteiner i cellelinjer og HAE-kulturer. Denne protokollen kan tilpasses for bruk i forskjellige cellemodeller, inkludert cellemonolayers eller spesifikke vev. Metoden er avhengig av konseptet med en HCR initiert av passende sondelokalisering. Deretter resulterer bruken av split-initiator sonder for å begynne fo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Vitenskaps- og høyere utdanningsdepartementet for forskning på SARS-CoV-2, og av tilskudd fra National Science Center (tilskudd UMO2017/27/B/NZ6/02488 til K.P. og UMO-2018/30/E/NZ1/00874 til A.K.-P.).
Materials
| Equipment | |||
| Confocal Microscope LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, Mini Rocker- Shaker | Fisher Scientific | 12965501 | |
| Incubator Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| Materials | |||
| 15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips | LabSolute | 7695022 | |
| 1.5 mL tubes | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| 12-well plate | TTP | 92412 | |
| Conical centrifuge tube | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| serological pipets | VWR Collection | 612-5523P, 612-5827P | |
| slide glass | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
| Reagents | |||
| Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies | Invitrogen | ||
| β5-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| Disodium phosphate | Sigma | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR Amplification Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S013922 | |
| HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S012522 | |
| HCR Probe Hybridization Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| HCR Probe Wash Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methanol | Sigma | 32213-1L-M | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655-100G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| PIPES | BioShop | PIP666.100 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P5405-250G | |
| Prolong Diamond Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36970 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.5 | |
| Trisodium Citrate 2-hydrate | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| Software | |||
| Fluorescence Spectraviewer | Modeling spectral parameters | ||
| ImageJ Fiji | Acquiring and processing z-stack images |
References
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
- Milewska, A., et al. Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium. Journal of Virology. 94, (2020).
- Banach, B. S., et al. Human airway epithelial cell culture to identify new respiratory viruses: coronavirus NL63 as a model. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 19-26 (2009).
- Milewska, A., et al. Entry of human coronavirus NL63 into the cell. Journal of Virology. 92, (2018).
- El Baba, R., Herbein, G. Management of epigenomic networks entailed in coronavirus infections and COVID-19. Clinical Epigenetics. 12, 118 (2020).
- Pinto, B. G. G., et al. ACE2 expression is increased in the lungs of patients with comorbidities associated with severe COVID-19. Journal of Infectious Diseases. 222 (4), 556-563 (2020).
- Verdecchia, P., Cavallini, C., Spanevello, A., Angeli, F. The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-CoV-2 infection. European Journal of Internal Medicine. 76, 14-20 (2020).
- Gordon, D. E., et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature. 583, 459-468 (2020).
- Ferron, F., Decroly, E., Selisko, B., Canard, B. The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs. Antiviral Research. 96 (1), 21-31 (2012).
- Mehta, S., Jeffrey, K. L. Beyond receptors and signaling: epigenetic factors in the regulation of innate immunity. Immunology and Cell Biology. 93 (3), 233-244 (2015).
- Poppe, M., et al. The NF-kappaB-dependent and -independent transcriptome and chromatin landscapes of human coronavirus 229E-infected cells. PLoS Pathogens. 13, 1006286 (2017).
- Schafer, A., Baric, R. S. Epigenetic landscape during coronavirus infection. Pathogens. 6 (1), 8 (2017).
- Carletti, T., et al. Viral priming of cell intrinsic innate antiviral signaling by the unfolded protein response. Nature Communications. 10, 3889 (2019).
- Heil, F., et al. Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science. 303 (5663), 1526-1529 (2004).
- Sze, A., et al. Host restriction factor SAMHD1 limits human T cell leukemia virus type 1 infection of monocytes via STING-mediated apoptosis. Cell Host and Microbe. 14 (4), 422-434 (2013).
- Kikkert, M. Innate immune evasion by human respiratory RNA viruses. Journal of Innate Immunity. 12, 4-20 (2020).
- Kennedy, E. M., et al. Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression. Cell Host and Microbe. 22 (6), 830 (2017).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
- Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. Visualizing coronavirus entry into cells. Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).
