Imagerie en temps réel à large champ des signaux de plaies locales et systémiques chez Arabidopsis

Summary

La signalisation systémique glutamate-déclenchée extracellulaire de calcium est critique pour l’induction des réponses de défense des plantes à la blessure mécanique et à l’attaque herbivore dans les plantes. Cet article décrit une méthode pour visualiser la dynamique spatiale et temporelle de ces deux facteurs utilisant des plantes de thaliana d’Arabidopsis exprimant des biocapteurs fluorescents calcium et glutamate-sensibles.

Abstract

Les plantes réagissent aux contraintes mécaniques telles que la blessure et l’herbivorie en induisant des réponses de défense à la fois dans les parties endommagées et dans les parties distales non endommagées. Lors du enroulement d’une feuille, une augmentation de la concentration cytosolique d’ions calcium (signal Ca²⁺⁾ se produit sur le site de la plaie. Ce signal est rapidement transmis aux feuilles intactes, où les réponses de défense sont activées. Nos recherches récentes ont révélé que le glutamate qui fuit des cellules blessées de la feuille dans l’apoplaste qui les entoure sert de signal de plaie. Ce glutamate active les canaux perméables Ca²⁺ de type récepteur du glutamate, ce qui conduit ensuite à la propagation du signal Ca²⁺ à longue distance dans toute la plante. Les caractéristiques spatiales et temporelles de ces événements peuvent être capturées avec l’imagerie en temps réel de plantes vivantes exprimant des biocapteurs fluorescents génétiquement codés. Ici, nous introduisons une méthode d’imagerie en temps réel à l’échelle de la plante pour surveiller la dynamique des signaux Ca^{2 +} et des changements dans le glutamate apoplasique qui se produisent en réponse à la blessure. Cette approche utilise un microscope à fluorescence à large champ et des plantes arabidopsis transgéniques exprimant des biocapteurs Ca²⁺ et glutamate à base de protéines fluorescentes vertes (GFP). En outre, nous présentons la méthodologie pour obtenir facilement la propagation rapide et à longue distance causée par la blessure et glutamate-déclenchée de signal de Ca^2+. Ce protocole peut également être appliqué à des études sur d’autres contraintes de la plante pour aider à étudier comment la signalisation systémique de la plante pourrait être impliquée dans leurs réseaux de signalisation et de réponse.

Introduction

Les plantes ne peuvent pas échapper aux stress biotiques, par exemple les insectes qui s’en nourrissent, elles ont donc développé des systèmes sophistiqués de détection du stress et de transduction des signaux pour détecter et ensuite se protéger contre des défis tels que l’herbivorie^1. Lors d’une blessure ou d’une attaque herbivore, les plantes déclenchent des réponses de défense rapides, y compris l’accumulation de l’acide jasmonique phytohormone (JA) non seulement sur le site blessé, mais également dans les organes distaux intacts^2. Ce JA déclenche alors à la fois des réponses de défense dans les tissus directement endommagés et induit préventivement des défenses dans les parties intactes de la plante. Chez Arabidopsis,l’accumulation de JA induite par la blessure a été détectée dans des feuilles distales et intactes en quelques minutes seulement après avoir été endommagées ailleurs dans la plante, ce qui suggère qu’un signal rapide et à longue distance est transmis à partir de la feuille blessée^3. Plusieurs candidats, tels que^Ca2+,les espèces réactives de l’oxygène (ROS), et les signaux électriques, ont été proposés pour servir de signaux enroulés à longue distance dans les plantes^4,5.

Ca²⁺ est l’un des éléments messagers deuxièmes les plus polyvalents et les plus omniprésents dans les organismes eucaryotes. Chez les plantes, la mastication des chenilles et les blessures mécaniques provoquent des augmentations drastiques de la concentration cytosolique de^{Ca2+ ([Ca2+}]_cyt)à la fois dans la feuille blessée et dans les feuilles éloignées non enroulées^6,7. Ce signal systémique^Ca2+ est reçu par des protéines de détection^ca2+intracellulaires, qui conduisent à l’activation des voies de signalisation de défense en aval, y compris la biosynthèse JA^8,9. En dépit de nombreux tels rapports soutenant l’importance des signaux de Ca²⁺ dans des réponses de blessure d’usine, l’information sur les caractéristiques spatiales et temporelles des signaux de Ca²⁺ induits par blessure est limitée.

L’imagerie en temps réel à l’aide d’indicateurs Ca²⁺ génétiquement codés est un outil puissant pour surveiller et quantifier la dynamique spatiale et temporelle des signaux Ca^2+. À ce jour, des versions de ces capteurs ont été développées qui permettent la visualisation des signaux Ca²⁺ au niveau d’une seule cellule, vers des tissus, des organes et même des plantes entières¹⁰. Le premier biocapteur génétiquement codé pour Ca²⁺ utilisé dans les plantes était la protéine bioluminescente aequorine dérivée de la méduse Aequorea victoria^11. Bien que cette protéine chimiluminescente ait été utilisée pour détecter les changements de^Ca2+ en réponse à diverses contraintes chez les plantes^{12,13,14,15,16,17,18,}elle n’est pas bien adaptée à l’imagerie en temps réel en raison du signal luminescent extrêmement faible qu’elle produit. Les indicateurs Ca²⁺ basés sur le transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET), tels que les caméléons jaunes, ont également été utilisés avec succès pour étudier la dynamique d’une gamme d’événements de signalisation Ca^{2 +} dans les plantes^{19,20,21,22,23,24.} Ces capteurs sont compatibles avec les approches d’imagerie et sont le plus souvent composés de la protéine de liaison Ca²⁺ calmoduline (CaM) et d’un peptide de liaison au CaM (M13) à partir d’une kinase à chaîne légère de myosine, toutes fusionnées entre deux protéines fluorophores, généralement une protéine fluorescente cyan (CFP) et une variante de protéine fluorescente jaune (YFP)^10. Ca²⁺ se liant au CaM favorise l’interaction entre le CaM et le M13 conduisant à un changement conformationnel du capteur. Ce changement favorise le transfert d’énergie entre le CFP et le YFP, ce qui augmente l’intensité de fluorescence du YFP tout en diminuant l’émission de fluorescence du CFP. La surveillance de ce passage de la CFP à la fluorescence YFP fournit ensuite une mesure de l’augmentation du niveau de Ca² +. En plus de ces capteurs FRET, les biocapteurs Ca²⁺ à base de protéines fluorescentes uniques (FP), tels que GCaMP et R-GECO, sont également compatibles avec les approches d’imagerie végétale et sont largement utilisés pour étudier les changements_{de cytaires} [Ca2+ ] en raison de leur sensibilité élevée et de leur facilité d’utilisation^{25,26,27,28,29,30.} Les GCaMPs contiennent un seul GFP permuté circulairement (cp), à nouveau fusionné au CaM et au peptide M13. L’interaction dépendante du Ca²⁺entre le CaM et le M13 provoque un changement conformationnel dans le capteur qui favorise un changement dans l’état de protonation du cpGFP, améliorant ainsi son signal fluorescent. Ainsi, à mesure que les niveaux de Ca²⁺ augmentent, le signal cpGFP augmente.

Pour étudier la dynamique des signaux Ca²⁺ générés en réponse à une blessure mécanique ou à une alimentation herbivore, nous avons utilisé des plantes transgéniques Arabidopsis thaliana exprimant une variante GCaMP, GCaMP3, et un microscope à fluorescence à large champ^6. Cette approche a réussi à visualiser la transmission rapide d’un signal Ca²⁺ longue distance du site de la plaie sur une feuille à la plante entière. Ainsi, une augmentation de [Ca²⁺]_cyt a été immédiatement détectée à l’emplacement de blessure mais ce signal de Ca²⁺ a été alors propagé aux feuilles voisines par la vascularisation dans quelques minutes de blessure. En outre, nous avons constaté que la transmission de ce signal de plaie systémique rapide est abolie dans les plantes Arabidopsis avec des mutations dans deux gènes récepteur-comme de glutamate, glutamate récepteur comme (GLR), GLR3.3, et GLR3.6^6. Les GLR semblent fonctionner comme des canaux Ca²⁺ à capté d’acides aminés impliqués dans divers processus physiologiques, y compris la réponse de la plaie^3,la croissance du tube^{pollinique 31,}le développement des racines^32,la réponse au froid³³et l’immunité innée^34. Malgré cette fonction physiologique large et bien comprise des GLRs, les informations sur leurs propriétés fonctionnelles, telles que leur spécificité de ligand, leur sélectivité ionique et leur localisation subcellulaire, sont limitées^{à 35.} Cependant, des études récentes ont rapporté que GLR3.3 et GLR3.6 sont localisés dans le phloème et le xylème, respectivement. Les GLR végétaux présentent des similitudes avec les récepteurs ionotropes du glutamate (iGluRs)³⁶ chez les mammifères, qui sont activés par des acides aminés, tels que le glutamate, la glycine et la D-sérine dans le système nerveux des mammifères^37. En effet, nous avons démontré que l’application de glutamate de 100 mM, mais pas d’autres acides aminés, sur le site de la plaie induit un signal^Ca2+ rapide et à longue distance chez Arabidopsis,indiquant que le glutamate extracellulaire agit probablement comme un signal de plaie dans les plantes^6. Cette réponse est supprimée dans le mutant glr3.3/glr3.6 suggérant que le glutamate peut agir par l’un ou les deux canaux de type récepteur et en effet, AtGLR3.6 s’est récemment avéré être fermée par ces niveaux de glutamate^38.

Dans les plantes, en plus de son rôle d’acide aminé structurel, le glutamate a également été proposé comme régulateur clé du développement³⁹; cependant, sa dynamique spatiale et temporelle est mal comprise. Tout comme pour le^Ca2+,plusieurs indicateurs génétiquement codés pour le glutamate ont été développés pour surveiller la dynamique de cet acide aminé dans les cellules vivantes^40,41. iGluSnFR est un biocapteur de glutamate mono-FP à base de GFP composé de cpGFP et d’une protéine de liaison au glutamate (GltI) d’Escherichia coli^42,43. Le changement conformationnel d’iGluSnFR, qui est induit par la liaison de glutamate à GltI, a comme conséquence une émission augmentée de fluorescence de GFP. Pour étudier si le glutamate extracellulaire agit comme une molécule de signalisation dans la réponse de la plaie végétale, nous avons connecté la séquence iGluSnFR avec la séquence de sécrétion peptidique signal de chitinase de base (CHIB-iGluSnFR) pour localiser ce biocapteur dans l’espace apoplasique^6. Cette approche a permis l’imagerie de tout changement dans la concentration de glutamate apoplasique ([Glu]_apo)en utilisant des plantes transgéniques d’Arabidopsis exprimant ce capteur. Nous avons détecté des augmentations rapides du signal d’iGluSnFR à l’emplacement de blessure. Ces données soutiennent l’idée que le glutamate s’échappe des cellules / tissus endommagés vers l’apoplaste lors de la blessure et agit comme un signal de dommage activant les GLRs et conduisant au signal Ca^{2 +} à longue distance dans les plantes^6.

Ici, nous décrivons une méthode d’imagerie en temps réel à l’échelle de la plante utilisant des biocapteurs génétiquement codés pour surveiller et analyser la dynamique des signaux Ca²⁺ à longue distance et extracellulaires du glutamate en réponse à la blessure^6. La disponibilité de la microscopie à fluorescence à large champ et de plantes transgéniques exprimant des biocapteurs génétiquement codés fournit une approche puissante, mais facile à mettre en œuvre pour détecter les signaux à longue distance transmis rapidement, tels que les ondes Ca^{2 +.}

Protocol

1. Préparation du matériel végétal Dans un microtube de 1,5 mL, stériliser en surface les graines de la plante Arabidopsis thaliana (Col-0 accession) exprimant soit GCaMP3, soit CHIB-iGluSnFR en secouant avec 20% (v/v) de NaClO pendant 3 min, puis laver 5 fois avec de l’eau distillée stérile.NOTE: Les lignées transgéniques d’Arabidopsis exprimant GCaMP3 ou CHIB-iGluSnFR ont été décrites précédemment6. Dans une hotte stérile, semez 13 gra…

Representative Results

La propagation du signal de[Ca2+]cyt et [Glu]apo en réponse à la blessure est présentée à la figure 3, à la figure 4, au film S1et au film S2. La coupe du pétiole de la feuille 1 chez les plantes exprimant GCaMP3 (à 0 s) a conduit à une augmentation significative ducyte [Ca2+]qui a été rapidement induite localement par la vasculari…

Discussion

La signalisation systémique est importante pour que les plantes réagissent à des stimuli environnementaux externes localisés, puis maintiennent leur homéostasie à un niveau de plante entière. Bien qu’ils ne soient pas équipés d’un système nerveux avancé comme les animaux, ils emploient une communication rapideà la fois à l’intérieur et entre les organes en fonction de facteurs tels que les signaux électriques mobiles (et éventuellement hydrauliques) et les ondes de propagation de ROS et<s…

Materials

Arabidopsis expressing GCaMP3	Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR	Saitama University
GraphPad Prism 7	GraphPad Software
L-Glutamate	FUJIFILM Wako	072-00501	Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel	Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium	FUJIFILM Wako	392-00591	composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope	Nikon
NIS-Elements AR analysis	Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO)	Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2)	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Square plastic Petri dish	Simport	D210-16