Широкоугольная визуализация в реальном времени локальных и системных сигналов раны при арабидопсисе

Summary

Внеклеточная систематическая передача кальция, вызванная глутаматом, имеет решающее значение для индукции реакций защиты растений на механическое ранение и атаку травоядных животных у растений. В данной статье описан метод визуализации пространственной и временной динамики обоих этих факторов с использованием растений Arabidopsis thaliana, экспрессирующих чувствительные к кальцию и глутамату флуоресцентные биосенсоры.

Abstract

Растения реагируют на механические напряжения, такие как раны и травоядные, вызывая защитные реакции как в поврежденных, так и в дистальных неповрежденными частях. При ранении листа на месте раны происходит повышение концентрации цитозольного иона кальция (сигнал Ca^2+). Этот сигнал быстро передается в неповрежденные листья, где активируются защитные реакции. Наше недавнее исследование показало, что глутамат, просачивающийся из раненых клеток листа в апопласт вокруг них, служит сигналом раны. Этот глутамат активирует глутамат-рецептороподобные каналы Ca^2+, что затем приводит к распространению сигнала Ca²⁺ на большие расстояния по всему растению. Пространственные и временные характеристики этих событий могут быть получены с помощью визуализации в реальном времени живых растений, экспрессирующих генетически закодированные флуоресцентные биосенсоры. Здесь мы представляем общезаводской метод визуализации в режиме реального времени для мониторинга динамики как сигналов Ca^2+, так и изменений в апопластическом глутамате, которые происходят в ответ на ранение. Этот подход использует широкоугольный флуоресцентный микроскоп и трансгенные растения Arabidopsis, экспрессирующие биосенсоры Ca²⁺ и глутамата на основе зеленого флуоресцентного белка (GFP). Кроме того, мы представляем методологию, которая легко вызывает раневое, вызванное глутаматом быстрое и дальнее распространение сигнала Ca^2+. Этот протокол также может быть применен к исследованиям других стрессов растений, чтобы помочь выяснить, как системная сигнализация растений может быть вовлечена в их сигнальные и ответные сети.

Introduction

Растения не могут избежать биотических стрессов, например, насекомые, питающиеся ими, поэтому они разработали сложные системы восприятия стресса и передачи сигналов, чтобы обнаружить, а затем защитить себя от таких проблем, как травоядные^1. При ранении или травоядной атаке растения инициируют быстрые защитные реакции, включая накопление фитогормонной жасмоновой кислоты (JA) не только в раненом месте, но и в неповрежденные дистальные органы^2. Затем эта JA вызывает защитные реакции в непосредственно поврежденных тканях и упреждающе индуцирует защиту в неповрежденных частях растения. У Arabidopsisнакопление JA, вызванное ранением, было обнаружено в дистальных, неповрежденных листьях всего за несколько минут после повреждения в другом месте растения, что говорит о том, что от раненого листа³передается быстрый и дальний сигнал. Несколько кандидатов, таких как Ca^2+,активные формы кислорода (АФК) и электрические сигналы, были предложены для того, чтобы служить в качестве этих сигналов на большие расстояния в растениях^4,5.

Ca²⁺ является одним из самых универсальных и вездесущих вторых мессенджеров в эукариотических организмах. У растений жевание гусениц и механическое ранение вызывают резкое повышение концентрации цитозоля Ca²⁺ ([Ca^2+]_cyt)как в раненом листе, так и в нераненых отдаленных листьях^6,7. Этот системный сигнал Ca²⁺ принимается внутриклеточными Ca²⁺-чувствительными белками, которые приводят к активации нисходящих защитных сигнальных путей, включая биосинтез JA^8,9. Несмотря на многочисленные такие сообщения, подтверждающие важность сигналов Ca²⁺ в реакциях на раны растений, информация о пространственных и временных характеристиках сигналов Ca^2+, вызванных ранением, ограничена.

Визуализация в режиме реального времени с использованием генетически закодированных индикаторов Ca²⁺ является мощным инструментом для мониторинга и количественной оценки пространственной и временной динамики сигналов Ca^2+. На сегодняшний день разработаны версии таких датчиков, позволяющие визуализировать сигналы Ca²⁺ на уровне одной клетки, к тканям, органам и даже целым растениям^10. Первым генетически закодированным биосенсором для Ca^2+, используемым в растениях, был биолюминесцентный белок экворин, полученный из медузы Aequorea victoria^11. Хотя этот хемилюминесцентный белок использовался для обнаружения изменений Ca²⁺ в ответ на различные стрессы в растениях^{12,13,14,15,16,17,18,}он не очень хорошо подходит для визуализации в режиме реального времени из-за чрезвычайно низкого люминесцентного сигнала, который он производит. Индикаторы Ca^2+, основанные на резонансном переносе энергии Фёрстера (FRET), такие как желтые камелоны, также успешно используются для исследования динамики диапазона сигнальных событий Ca²⁺ в растениях^{19,20,21,22,23,24.} Эти датчики совместимы с подходами к визуализации и чаще всего состоят из Ca^2+, связывающего белка кальмодулина (CaM) и CaM-связывающего пептида (M13) из миозиновой киназы легкой цепи, все они слиты между двумя флуорофорными белками, как правило, синим флуоресцентным белком (CFP) и вариантом желтого флуоресцентного белка (YFP)^10. Связывание Ca²⁺ с CaM способствует взаимодействию между CaM и M13, что приводит к конформационному изменению датчика. Это изменение способствует передаче энергии между CFP и YFP, что увеличивает интенсивность флуоресценции YFP при одновременном уменьшении флуоресцентного излучения от CFP. Мониторинг этого перехода от флуоресценции CFP к флуоресценции YFP затем обеспечивает измерение увеличения уровня Ca^2+. В дополнение к этим датчикам FRET, биосенсоры Ca²⁺ на основе одного флуоресцентного белка (FP), такие как GCaMP и R-GECO, также совместимы с подходами к визуализации растений и широко используются для изучения изменений_цит [Ca^2+]из-за их высокой чувствительности и простоты использования^{25,26,27,28,29,30.} GCaMP содержат один циркулярно перестановленный (cp) GFP, снова сплавленный с CaM и пептидом M13. Ca²⁺-зависимое взаимодействие между CaM и M13 вызывает конформационное изменение датчика, которое способствует сдвигу в протонационном состоянии cpGFP, усиливая его флуоресцентный сигнал. Таким образом, по мере повышения уровня Ca²⁺ сигнал cpGFP увеличивается.

Чтобы исследовать динамику сигналов Ca^2+, генерируемых в ответ на механическое ранение или кормление травоядных, мы использовали трансгенные растения Arabidopsis thaliana, экспрессирующие вариант GCaMP, GCaMP3, и широкопольный флуоресцентный микроскоп^6. Этот подход позволил визуализировать быструю передачу сигнала Ca²⁺ на большие расстояния от места раны на листе ко всему растению. Таким образом, увеличение_циты [Ca^2+]было немедленно обнаружено в месте раны, но этот сигнал Ca^{2 +} затем распространялся на соседние листья через сосудистую азкулятуру в течение нескольких минут после ранения. Кроме того, мы обнаружили, что передача этого быстрого системного сигнала раны отменяется у растений Arabidopsis с мутациями в двух генах, подобных рецепторам глутамата, Glutamate Receptor Like (GLR), GLR3.3 и GLR3.6^6. GLR, по-видимому, функционируют как аминокислотные закрытые каналы Ca^2+, участвующие в различных физиологических процессах, включая раневую реакцию^3,рост пыльцевой трубки^31,развитие корней^32,холодный ответ³³и врожденный иммунитет^34. Несмотря на эту хорошо понятную, широкую физиологическую функцию GLR, информация об их функциональных свойствах, таких как их лигандная специфичность, селективность ионов и субклеточная локализация, ограничена^35. Однако недавние исследования показали, что GLR3.3 и GLR3.6 локализованы во флоэме и ксилеме соответственно. Растительные GLR имеют сходство с ионотропными глутаматными рецепторами (iGluRs)³⁶ у млекопитающих, которые активируются аминокислотами, такими как глутамат, глицин и D-серин в нервной системе млекопитающих^37. Действительно, мы продемонстрировали, что применение глутамата 100 мМ, но не других аминокислот, в месте раны индуцирует быстрый, дальний сигнал Ca²⁺ у Arabidopsis,что указывает на то, что внеклеточный глутамат, вероятно, действует как раневой сигнал у растений^6. Этот ответ отменяется у мутанта glr3.3/glr3.6, предполагая, что глутамат может действовать через один или оба из этих рецептороподобных каналов, и действительно, недавно было показано, что AtGLR3.6 ограничен этими уровнями глутамата^38.

В растениях, в дополнение к своей роли в качестве структурной аминокислоты, глутамат также был предложен в качестве ключевого регулятора развития^39; однако его пространственная и временная динамика плохо изучена. Так же, как и для Ca^2+,было разработано несколько генетически закодированных индикаторов для глутамата для мониторинга динамики этой аминокислоты в живых клетках^40,41. iGluSnFR представляет собой биосенсор глутамата на основе GFP, состоящий из cpGFP и глутаматсвязывающего белка (GltI) из Escherichia coli^42,43. Конформационное изменение iGluSnFR, которое индуцируется связыванием глутамата с GltI, приводит к усиленному флуоресцентному излучению GFP. Чтобы исследовать, действует ли внеклеточный глутамат как сигнальная молекула в реакции раны растений, мы связали последовательность iGluSnFR с основной последовательностью секреции сигнального пептида хитиназы (CHIB-iGluSnFR) для локализации этого биосенсора в апопластическом пространстве^6. Этот подход позволил визуализировать любые изменения концентрации апопластического глутамата ([Glu]_apo)с использованием трансгенных растений Arabidopsis, экспрессирующих этот датчик. Мы обнаружили быстрое увеличение сигнала iGluSnFR в месте ранения. Эти данные подтверждают идею о том, что глутамат просачивается из поврежденных клеток / тканей в апопласт при ранении и действует как сигнал повреждения, активирующий GLR и приводящий к сигналу Ca^{2 +} на большом расстоянии у растений^6.

Здесь мы описываем общезаводской метод визуализации в режиме реального времени с использованием генетически закодированных биосенсоров для мониторинга и анализа динамики сигналов Ca²⁺ и внеклеточных сигналов глутамата на большие расстояния в ответ на ранение^6. Наличие широкоугольной флуоресцентной микроскопии и трансгенных растений, экспрессирующих генетически закодированные биосенсоры, обеспечивает мощный, но легко реализуемый подход к обнаружению быстро передаваемых сигналов на большие расстояния, таких как волны Ca^2+.

Protocol

1. Подготовка растительного сырья В микротрубке 1,5 мл поверхностно стерилизуют семена растения Arabidopsis thaliana (присоединение Col-0), экспрессируя либо GCaMP3, либо CHIB-iGluSnFR путем встряхивания с 20% (v/v) NaClO в течение 3 мин, а затем промыть 5 раз стерильной дистиллированной водой.ПРИМЕЧАНИЕ…

Representative Results

Распространение сигнала [Ca2+]cyt и [Glu]apo в ответ на ранение представлено на рисунке 3, рисунке 4, фильме S1и фильме S2. Обрезание черешка листа 1 у растений, экспрессировающих GCaMP3 (при 0 с), привело к значительн…

Discussion

Системная сигнализация важна для растений, чтобы реагировать на локализованные внешние раздражители окружающей среды, а затем поддерживать свой гомеостаз на уровне всего растения. Хотя они не оснащены развитой нервной системой, как животные, они используют быструю связь как внутри, т?…

Materials

Arabidopsis expressing GCaMP3	Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR	Saitama University
GraphPad Prism 7	GraphPad Software
L-Glutamate	FUJIFILM Wako	072-00501	Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel	Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium	FUJIFILM Wako	392-00591	composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope	Nikon
NIS-Elements AR analysis	Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO)	Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2)	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Square plastic Petri dish	Simport	D210-16