Wide-Field, Real-Time Imaging af lokale og systemiske sårsignaler i Arabidopsis

Summary

Ekstracellulær glutamat-udløst systemisk calcium signalering er afgørende for induktion af planteforsvar svar på mekaniske sår og planteædende angreb i planter. Denne artikel beskriver en metode til at visualisere den rumlige og tidsmæssige dynamik i begge disse faktorer ved hjælp af Arabidopsis thaliana planter udtrykke calcium- og glutamat-følsomme fluorescerende biosensorer.

Abstract

Planter reagerer på mekaniske belastninger såsom sår og planteædende ved at fremkalde forsvarsresponser både i de beskadigede og i de distale ubeskadigede dele. Ved såning af et blad sker der en stigning i cytosolic calciumionkoncentration (Ca²⁺ signal) på såret. Dette signal sendes hurtigt til ubeskadigede blade, hvor forsvarsresponser aktiveres. Vores seneste forskning viste, at glutamat lækker fra de sårede celler i bladet i apoplast omkring dem tjener som et sår signal. Dette glutamat aktiverer glutamat receptor-lignende Ca^{2 +} gennemtrængelige kanaler, som derefter fører til langdistance Ca^{2 +} signal formering i hele planten. Disse hændelsers rumlige og tidsmæssige karakteristika kan indfanges med realtidsbilleddannelse af levende planter, der udtrykker genetisk kodede fluorescerende biosensorer. Her introducerer vi en billeddannelsesmetode i hele fabrikken til at overvåge dynamikken i både Ca^{2+-signalerne} og ændringer i apoplastisk glutamat, der opstår som reaktion på sår. Denne fremgangsmåde bruger et bredfelts fluorescensmikroskop og transgene Arabidopsis-planter, der udtrykker grønne fluorescerende protein (GFP)-baserede Ca²⁺ og glutamatbiosensorer. Derudover præsenterer vi metode til let at fremkalde sår-induceret, glutamat-udløst hurtig og langdistance Ca^{2 +} signal formering. Denne protokol kan også anvendes på undersøgelser af andre anlæg understreger at hjælpe med at undersøge, hvordan anlægget systemiske signalering kan være involveret i deres signalering og respons netværk.

Introduction

Planter kan ikke undslippe fra biotiske belastninger, f.eks. insekter, der fodrer dem, så de har udviklet sofistikerede stresssensorer og signaltransduktionssystemer til at opdage og derefter beskytte sig mod udfordringer som planteæder¹. Ved sår eller planteædende angreb indleder planter hurtige forsvarsresponser, herunder akkumulering af phytohormone jasmonsyre (JA) ikke kun på det sårede sted, men også i ubeskadigede distale organer². Denne JA så både udløser forsvar svar i direkte beskadigede væv og forebyggende inducerer forsvar i ubeskadigede dele af planten. I Arabidopsisblev akkumulering af JA induceret af sår opdaget i distale, intakte blade inden for få minutter efter skader andre steder i planten, hvilket tyder på, at et hurtigt og langdistancesignal overføres fra det sårede blad³. Flere kandidater, såsom Ca^{2 +}, reaktiv ilt arter (ROS), og elektriske signaler, er blevet foreslået at tjene som disse langdistance sår signaler i anlæg^4,5.

Ca²⁺ er et af de mest alsidige og allestedsnærværende andet budbringerelementer i eukaryote organismer. I planter forårsager larve tygge og mekanisk sår drastiske stigninger i den cytosolske Ca^{2 +} koncentration ([Ca^{2 +}]_cyt) både i det sårede blad og i uhelede fjerne blade^6,7. Dette systemiske Ca²⁺ signal modtages af intracellulære Ca²⁺-sensing proteiner, som fører til aktivering af downstream forsvarssignalveje, herunder JA biosyntese^8,9. På trods af talrige sådanne rapporter, der støtter betydningen af Ca^2+-signaler i skudsårsresponser, er oplysninger om de rumlige og tidsmæssige karakteristika ved Ca^2+-signaler fremkaldt af sår begrænset.

Realtidsbilleddannelse ved hjælp af genetisk kodede Ca^{2+-indikatorer} er et effektivt værktøj til at overvåge og kvantificere den rumlige og tidsmæssige dynamik i Ca^2+-signaler. Til dato er der udviklet versioner af sådanne sensorer, der muliggør visualisering af Ca^{2 +} signaler på niveau med en enkelt celle, til væv, organer og endda hele planter¹⁰. Den første genetisk kodede biosensor for Ca^2+, der blev anvendt i planter, var det bioluminescerende protein aequorin, der stammer fra vandmændene Aequorea victoria¹¹. Selv om dette chemiluminescent protein er blevet brugt til at opdage Ca^{2 +} ændringer som reaktion på forskellige belastninger i planter^{12,13,14,15,16,17,18}, det er ikke velegnet til real-time billeddannelse på grund af den ekstremt lave selvlysende signal, den producerer. Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-baserede Ca²⁺ indikatorer, såsom de gule cameleoner, er også blevet anvendt med succes til at undersøge dynamikken i en række Ca²⁺ signalhændelser i anlæg^{19,20,21,22,23,24}. Disse sensorer er kompatible med billeddannelse tilgange og oftest er sammensat af Ca^{2 +} bindende protein calmodulin (CaM) og en CaM-bindende peptid (M13) fra en myosin lyskæde kinase, alle smeltet mellem to fluorophore proteiner, generelt en Cyan Fluorescerende Protein (CFP) og en gul fluorescerende Protein variant (YFP)¹⁰. Ca²⁺ binding til CaM fremmer samspillet mellem CaM og M13, hvilket fører til en kropsbygningsændring af sensoren. Denne ændring fremmer energioverførsel mellem den fælles fiskeripolitik og YFP, hvilket øger YFP’ens fluorescensintensitet, samtidig med at fluorescensemissionen mindskes fra den fælles fiskeripolitik. Overvågning af dette skift fra den fælles fiskeripolitik til YFP-fluorescens giver derefter et mål for stigningen i Ca^2+-niveau. Ud over disse FRET sensorer, enkelt fluorescerende protein (FP)-baserede Ca^{2 +} biosensorer, såsom GCaMP og R-GECO, er også kompatible med plante billeddannelse tilgange og er meget udbredt til at studere [Ca^{2 +}]_cyt ændringer på grund af deres høje følsomhed og brugervenlighed^{25,26,27,28,29,30}. GCaMPs indeholder en enkelt cirkulært permuteret (cp) GFP, igen smeltet til CaM og M13 peptid. Ca²⁺-afhængig interaktion mellem CaM og M13 forårsager en kropsbygningsændring i sensoren, der fremmer et skift i protonationstilstanden af cpGFP, hvilket øger dets fluorescerende signal. Således, som Ca^{2 +} niveauer stiger, cpGFP signalet stiger.

For at undersøge dynamikken i Ca^{2 +} signaler genereret som reaktion på mekanisk sår eller planteæder fodring, har vi brugt transgene Arabidopsis thaliana planter udtrykke en GCaMP variant, GCaMP3, og en bred felt fluorescens mikroskop⁶. Denne tilgang har formået at visualisere hurtig transmission af et langdistance Ca^{2 +} signal fra sårstedet på et blad til hele planten. Således blev en stigning i [Ca^{2 +}]_cyt straks opdaget på sårstedet, men dette Ca^{2 +} signal blev derefter overført til de nærliggende blade gennem vaskulaturen inden for få minutter efter sår. Desuden fandt vi, at overførslen af dette hurtige systemiske sårsignal afskaffes i Arabidopsis-planter med mutationer i to glutamatreceptorlignende gener, Glutamat receptor som (GLR), GLR3.3 og GLR3.6⁶. Den GLRs synes at fungere som amino-syre gated Ca^{2 +} kanaler involveret i forskellige fysiologiske processer, herunder sårrespons³, pollen rør vækst³¹, rod udvikling³², kold^{respons 33}, og medfødte immunitet³⁴. På trods af denne velkendte, brede fysiologiske funktion af GLR’erne er oplysninger om deres funktionelle egenskaber, såsom deres ligand specificitet, ion selektivitet og subcellulær lokalisering, begrænset³⁵. Nylige undersøgelser rapporterede imidlertid, at GLR3.3 og GLR3.6 er lokaliseret i henholdsvis phloem og xylem. Plant GLRs har ligheder med ionotrope glutamatreceptorer (iGluRs)³⁶ hos pattedyr, som aktiveres af aminosyrer, såsom glutamat, glycin og D-serin i pattedyrsnervesystemet³⁷. Faktisk har vi vist, at anvendelsen af 100 mM glutamat, men ikke andre aminosyrer, på sårstedet fremkalder et hurtigt, langdistance Ca^{2 +} signal i Arabidopsis, hvilket indikerer, at ekstracellulær glutamat sandsynligvis fungerer som et sårsignal i planter⁶. Dette svar er afskaffet i glr3.3/glr3.6 mutant tyder på, at glutamat kan virke gennem en eller begge af disse receptor-lignende kanaler og ja, AtGLR3.6 blev for nylig vist sig at være gated af disse niveauer af glutamat³⁸.

I planter er glutamat ud over sin rolle som strukturel aminosyre også blevet foreslået som en vigtig udviklingsregulator^39; dens rumlige og tidsmæssige dynamik er imidlertid dårligt forstået. Ligesom for Ca²⁺er der udviklet flere genetisk kodede indikatorer for glutamat til at overvåge dynamikken i denne aminosyre i levende celler^40,41. iGluSnFR er en GFP-baseret enkelt-FP glutamat biosensor bestående af cpGFP og et glutamat bindende protein (GltI) fra Escherichia coli^42,43. Den kropsbygningsændring af iGluSnFR, der er forårsaget af glutamatbinding til GltI, resulterer i en forbedret GFP-fluorescensemission. For at undersøge, om ekstracellulær glutamat fungerer som et signalmolekyle i plantens sårrespons, forbandt vi iGluSnFR-sekvensen med den grundlæggende chitinase signal peptidsekretionssekvens (CHIB-iGluSnFR) for at lokalisere denne biosensor i det apoplastiske rum⁶. Denne fremgangsmåde muliggjorde billeddannelse af eventuelle ændringer i koncentrationen af apoplastisk glutamat ([Glu]_apo) ved hjælp af transgene Arabidopsis-planter, der udtrykker denne sensor. Vi opdagede hurtige stigninger i iGluSnFR-signalet på det sårende sted. Disse data understøtter tanken om, at glutamat lækker ud af de beskadigede celler / væv til apoplast ved sår og fungerer som et skadesignal, der aktiverer GLR’erne og fører til langdistance Ca^{2 +} signal i planter⁶.

Her beskriver vi en plantedækkende realtidsbilleddannelsesmetode ved hjælp af genetisk kodede biosensorer til at overvåge og analysere dynamikken i langdistance Ca²⁺ og ekstracellulære glutamatsignaler som reaktion på sårende⁶. Tilgængeligheden af bredfelts fluorescensmikroskopi og transgene planter, der udtrykker genetisk kodede biosensorer, giver en kraftfuld, men let implementeret tilgang til at detektere hurtigt transmitterede langdistancesignaler, såsom Ca²⁺ bølger.

Protocol

1. Fremstilling af plantemateriale I et 1,5 mL mikrorør steriliseres frøene af Arabidopsis thaliana (Kol-0 tiltrædelse) anlæg, der udtrykker enten GCaMP3 eller CHIB-iGluSnFR ved at ryste med 20% (v/ v) NaClO i 3 minutter og derefter vaske 5 gange med sterilt destilleret vand.BEMÆRK: De transgene linjer i Arabidopsis, der udtrykker GCaMP3 eller CHIB-iGluSnFR, er tidligere beskrevet6. I en steril hætte, så 13 overflade-steriliserede frø på en 10 cm …

Representative Results

Signaludbredelse af [Ca2+]cyt og [Glu]apo som reaktion på sår er præsenteret i figur 3, figur 4, Movie S1og Movie S2. Skæring af bladbladets petiole 1 i planter, der udtrykker GCaMP3 (ved 0 s), førte til en betydelig stigning i [Ca2+]cyt, der hurtigt blev induceret lokalt gennem vaskulaturen (ved 40 s) (Figur 3</stro…

Discussion

Systemisk signalering er vigtig for planter til at reagere på lokaliserede eksterne miljømæssige stimuli og derefter at opretholde deres homøostase på et helt anlægsniveau. Selv om de ikke er udstyret med et avanceret nervesystem som dyr, de beskæftiger hurtig kommunikation både inden for og mellem organer baseret på faktorer som mobile elektriske (og muligvis hydrauliske) signaler og formering bølger af ROS og Ca^{2 + 46,47}. Den ovenfor beskr…

Materials

Arabidopsis expressing GCaMP3	Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR	Saitama University
GraphPad Prism 7	GraphPad Software
L-Glutamate	FUJIFILM Wako	072-00501	Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel	Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium	FUJIFILM Wako	392-00591	composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope	Nikon
NIS-Elements AR analysis	Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO)	Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2)	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Square plastic Petri dish	Simport	D210-16