Wide-Field, Real-Time Beeldvorming van lokale en systemische wondsignalen bij Arabidopsis

Summary

Extracellulaire glutamaat-geactiveerde systemische calcium signalering is van cruciaal belang voor de inductie van plantenverdedigingsreacties op mechanische wond- en herbivore-aanval in planten. Dit artikel beschrijft een methode om de ruimtelijke en temporele dynamiek van beide factoren te visualiseren met behulp van Arabidopsis thaliana-planten die calcium- en glutamaatgevoelige fluorescerende biosensoren uitdrukken.

Abstract

Planten reageren op mechanische spanningen zoals wond- en herbivoren door afweerreacties op te wekken, zowel in de beschadigde als in de distale onbeschadigde delen. Bij het verwonden van een blad treedt een toename van de cytosolische calciumionconcentratie (Ca²⁺ signaal) op de wondplaats op. Dit signaal wordt snel doorgegeven aan onbeschadigde bladeren, waar verdedigingsreacties worden geactiveerd. Ons recente onderzoek onthulde dat glutamaat dat uit de gewonde cellen van het blad lekt in de apoplast om hen heen dient als wondsignaal. Dit glutamaat activeert glutamaat^{receptor-achtige Ca 2+} doorlaatbare kanalen, wat vervolgens leidt tot lange afstand Ca²⁺ signaal propagatie door de hele plant. De ruimtelijke en temporele kenmerken van deze gebeurtenissen kunnen worden vastgelegd met real-time beeldvorming van levende planten die genetisch gecodeerde fluorescerende biosensoren uitdrukken. Hier introduceren we een plantbrede, real-time beeldvormingsmethode om de dynamiek van zowel de Ca²⁺ signalen als veranderingen in apoplastisch glutamaat die optreden als reactie op wondvorming te monitoren. Deze aanpak maakt gebruik van een breedveldfluorescentiemicroscoop en transgene Arabidopsis-planten die op groen fluorescerend eiwit (GFP) gebaseerde Ca²⁺ en glutamaatbiosensoren uitdrukken. Daarnaast presenteren we methodologie om gemakkelijk wondgeïnduceerde, glutamaat-geactiveerde snelle en lange afstand Ca^{2 +} signaalvoortplanting uit te lokken. Dit protocol kan ook worden toegepast op studies over andere plantenspanningen om te helpen onderzoeken hoe systemische signalering van planten betrokken kan zijn bij hun signalerings- en responsnetwerken.

Introduction

Planten kunnen niet ontsnappen aan biotische spanningen, bijvoorbeeld insecten die zich ermee voeden, dus hebben ze geavanceerde stressdetectie- en signaaltransductiesystemen ontwikkeld om te detecteren en zichzelf vervolgens te beschermen tegen uitdagingen zoals herbivoren¹. Bij een wond- of herbivore aanval initiëren planten snelle afweerreacties, waaronder accumulatie van het fytohormoon jasmonzuur (JA), niet alleen op de gewonde plaats, maar ook in onbeschadigde distale organen². Deze JA activeert vervolgens beide afweerreacties in de direct beschadigde weefsels en induceert preventief afweer in de onbeschadigde delen van de plant. Bij Arabidopsiswerd de accumulatie van JA veroorzaakt door verwonding gedetecteerd in distale, intacte bladeren binnen slechts een paar minuten na schade elders in de plant, wat suggereert dat een snel en langeafstandssignaal wordt overgedragen van het gewonde blad³. Verschillende kandidaten, zoals Ca^2+,reactieve zuurstofsoorten (ROS) en elektrische signalen, zijn voorgesteld om te dienen als deze langeafstandswondsignalen in planten^4,5.

Ca²⁺ is een van de meest veelzijdige en alomtegenwoordige tweede boodschapperelementen in eukaryotische organismen. In planten veroorzaken het kauwen van rupsen en mechanische wond drastische verhogingen van de cytosolische Ca²⁺ concentratie ([Ca²⁺]_cyt) zowel in het gewonde blad als in ongewikkelde verre bladeren^6,7. Dit systemische Ca²⁺ signaal wordt ontvangen door intracellulaire Ca²⁺-sensing eiwitten, die leiden tot de activering van downstream verdedigingssignaleringsroutes, waaronder JA-biosynthese^8,9. Ondanks talrijke dergelijke rapporten die het belang van Ca²⁺ signalen in de reacties op plantenwonden ondersteunen, is de informatie over de ruimtelijke en temporele kenmerken van Ca²⁺ signalen veroorzaakt door verwonding beperkt.

Real-time beeldvorming met behulp van genetisch gecodeerde Ca²⁺ indicatoren is een krachtig instrument om de ruimtelijke en temporele dynamiek van Ca²⁺ signalen te monitoren en te kwantificeren. Tot op heden zijn versies van dergelijke sensoren ontwikkeld die de visualisatie van Ca²⁺ signalen op het niveau van een enkele cel, naar weefsels, organen en zelfs hele planten mogelijk maken¹⁰. De eerste genetisch gecodeerde biosensor voor Ca²⁺ gebruikt in planten was het bioluminescente eiwit aequorin afgeleid van de kwal Aequorea victoria¹¹. Hoewel dit chemiluminescente eiwit is gebruikt om Ca^{2 +} veranderingen te detecteren in reactie op verschillende spanningen in planten^{12,13,14,15,16,17,18}, is het niet goed geschikt voor real-time beeldvorming vanwege het extreem lage luminescente signaal dat het produceert. Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-gebaseerde Ca²⁺ indicatoren, zoals de Gele cameleons, zijn ook met succes gebruikt om de dynamiek van een reeks Ca²⁺ signaleringsgebeurtenissen in planten^{19,20,21,22,23,24}te onderzoeken . Deze sensoren zijn compatibel met beeldvormingsbenaderingen en bestaan meestal uit het Ca²⁺ bindende eiwit calmodulin (CaM) en een CaM-bindend peptide (M13) uit een myosine lichtketenkinase, allemaal versmolten tussen twee fluorofooreiwitten, over het algemeen een Cyaan Fluorescerend Eiwit (CFP) en een Gele Fluorescerende Eiwit variant (YFP)¹⁰. Ca²⁺ binding aan CaM bevordert de interactie tussen CaM en M13, wat leidt tot een conformationele verandering van de sensor. Deze verandering bevordert de energieoverdracht tussen het GVB en het GVB, waardoor de fluorescentie-intensiteit van het GVB toeneemt en tegelijkertijd de fluorescentie-emissie van het GVB afneemt. Het monitoren van deze verschuiving van GVB naar YFP fluorescentie geeft dan een maat voor de toename van ca²⁺ niveau. Naast deze FRET-sensoren zijn single fluorescent protein (FP)-gebaseerde Ca²⁺ biosensoren, zoals GCaMP en R-GECO, ook compatibel met plant imaging benaderingen en worden ze veel gebruikt om [Ca²⁺]_{cytveranderingen} te bestuderen vanwege hun hoge gevoeligheid en gebruiksgemak^{25,26,27,28,29,30}. GCaMP’s bevatten een enkele circulair gepermuteerde (cp) GFP, opnieuw gefuseerd met CaM en het M13-peptide. De Ca²⁺-afhankelijke interactie tussen CaM en M13 veroorzaakt een conformationele verandering in de sensor die een verschuiving in de protonatietoestand van de cpGFP bevordert, waardoor het fluorescerende signaal wordt verbeterd. Dus naarmate ca²⁺ niveaus stijgen, neemt het cpGFP-signaal toe.

Om de dynamiek van Ca²⁺ signalen te onderzoeken die worden gegenereerd als reactie op mechanische wond- of herbivore voeding, hebben we transgene Arabidopsis thaliana-planten gebruikt die een GCaMP-variant, GCaMP3 en een fluorescentiemicroscoop in het breed veld uitdrukken⁶. Deze aanpak is erin geslaagd om een snelle overdracht van een ca²⁺ signaal over lange afstand van de wondplaats op een blad naar de hele plant te visualiseren. Zo werd een toename van [Ca²⁺]_cyt onmiddellijk gedetecteerd op de wondplaats, maar dit Ca^{2 +} signaal werd vervolgens binnen een paar minuten na het verwonden doorgegeven aan de naburige bladeren door de vasculatuur. Bovendien ontdekten we dat de overdracht van dit snelle systemische wondsignaal wordt afgeschaft in Arabidopsis-planten met mutaties in twee glutamaatreceptorachtige genen, Glutamaatreceptor Zoals (GLR), GLR3.3 en GLR3.6⁶. De GLR’s lijken te functioneren als aminozuur gated Ca²⁺ kanalen die betrokken zijn bij diverse fysiologische processen, waaronder wondrespons³, pollenbuisgroei³¹, wortelontwikkeling³², koude respons³³, en aangeboren immuniteit³⁴. Ondanks deze goed begrepen, brede fysiologische functie van de GLR’s, is informatie over hun functionele eigenschappen, zoals hun ligand specificiteit, ion selectiviteit en subcellulaire lokalisatie, beperkt³⁵. Recente studies meldden echter dat GLR3.3 en GLR3.6 gelokaliseerd zijn in respectievelijk het floëem en xyleem. Planten-GLR’s vertonen overeenkomsten met ionotrope glutamaatreceptoren (iGluRs)³⁶ bij zoogdieren, die worden geactiveerd door aminozuren, zoals glutamaat, glycine en D-serine in het zenuwstelsel van zoogdieren³⁷. We hebben inderdaad aangetoond dat de toepassing van 100 mM glutamaat, maar niet van andere aminozuren, op de wondplaats een snel Ca²⁺ signaal op lange afstand induceert in Arabidopsis, wat aangeeft dat extracellulair glutamaat waarschijnlijk fungeert als een wondsignaal in planten⁶. Deze reactie wordt afgeschaft in de glr3.3/glr3.6 mutant wat suggereert dat glutamaat kan werken via een of beide van deze receptor-achtige kanalen en inderdaad, AtGLR3.6 werd onlangs aangetoond te worden gated door deze niveaus van glutamaat³⁸.

In planten is, naast zijn rol als structureel aminozuur, ook glutamaat voorgesteld als een belangrijke ontwikkelingsregulator³⁹; de ruimtelijke en temporele dynamiek worden echter slecht begrepen. Net als voor Ca²⁺zijn er verschillende genetisch gecodeerde indicatoren voor glutamaat ontwikkeld om de dynamiek van dit aminozuur in levende cellen^40,41te monitoren . iGluSnFR is een GFP-gebaseerde single-FP glutamaat biosensor bestaande uit cpGFP en een glutamaatbindend eiwit (GltI) uit Escherichia coli^42,43. De conformationele verandering van iGluSnFR, die wordt veroorzaakt door glutamaatbinding aan GltI, resulteert in een verbeterde GFP-fluorescentie-emissie. Om te onderzoeken of extracellulair glutamaat fungeert als een signaalmolecuul in de reactie van plantenwonden, hebben we de iGluSnFR-sequentie verbonden met de basis chitinase signaalpeptide secretiesequentie (CHIB-iGluSnFR) om deze biosensor in de apoplastische ruimte te lokaliseren⁶. Deze aanpak maakte beeldvorming mogelijk van eventuele veranderingen in de apoplastische glutamaatconcentratie ([Glu]_apo) met behulp van transgene Arabidopsis-planten die deze sensor uitdrukken. We ontdekten snelle toenames van het iGluSnFR-signaal op de wondplaats. Deze gegevens ondersteunen het idee dat glutamaat uit de beschadigde cellen / weefsels naar de apoplast lekt bij het verwonden en fungeert als een schadesignaal dat de GLR’s activeert en leidt tot het ca^{2 +} -signaal over lange afstand in planten⁶.

Hier beschrijven we een plantbrede real-time beeldvormingsmethode met behulp van genetisch gecodeerde biosensoren om de dynamiek van langeafstandssignalen ca²⁺ en extracellulair glutamaat te monitoren en te analyseren als reactie op^{wondvorming 6}. De beschikbaarheid van breedveldfluorescentiemicroscopie en transgene planten die genetisch gecodeerde biosensoren uitdrukken, biedt een krachtige, maar gemakkelijk te implementeren aanpak om snel overgedragen langeafstandssignalen, zoals Ca²⁺ golven, te detecteren.

Protocol

1. Voorbereiding van plantaardig materiaal Steriliseer in een microbuis van 1,5 ml de zaden van de Arabidopsis thaliana (Col-0 toetredings)plant, die GCaMP3 of CHIB-iGluSnFR uitdrukt door 3 minuten met 20% (v/v) NaClO te schudden en vervolgens 5 keer te wassen met steriel gedestilleerd water.OPMERKING: De transgene lijnen van Arabidopsis die GCaMP3 of CHIB-iGluSnFR uitdrukken, zijn eerder beschreven6. Zaai in een steriele kap 13 oppervlaktegesteriliseerde …

Representative Results

Signaalvoortplanting van [Ca2+]cyt en [Glu]apo als reactie op verwondingen wordt weergegeven in figuur 3, figuur 4, film S1en film S2. Het snijden van de bladsteel van blad 1 in planten die GCaMP3 uitdrukken (bij 0 s) leidde tot een significante toename van [Ca2+]cyt die lokaal snel werd geïnduceerd door de vasculatuur (bij 40 s) (<strong cl…

Discussion

Systemische signalering is belangrijk voor planten om te reageren op gelokaliseerde externe omgevingsprikkels en vervolgens hun homeostase op een heel plantniveau te behouden. Hoewel ze niet zijn uitgerust met een geavanceerd zenuwstelsel zoals dieren, maken ze gebruik van snelle communicatie zowel binnen als tussen organen op basis van factoren zoals mobiele elektrische (en mogelijk hydraulische) signalen en voortplantingsgolven van ROS en Ca^2+ 46,47…

Materials

Arabidopsis expressing GCaMP3	Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR	Saitama University
GraphPad Prism 7	GraphPad Software
L-Glutamate	FUJIFILM Wako	072-00501	Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel	Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium	FUJIFILM Wako	392-00591	composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope	Nikon
NIS-Elements AR analysis	Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO)	Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2)	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Square plastic Petri dish	Simport	D210-16