Weitfeld-Echtzeit-Bildgebung lokaler und systemischer Wundsignale bei Arabidopsis

Summary

Extrazelluläre Glutamat-ausgelöste systemische Kalziumsignalisierung ist entscheidend für die Induktion von pflanzlichen Abwehrreaktionen auf mechanische Wunden und Pflanzenfresserangriffe in Pflanzen. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um die räumliche und zeitliche Dynamik dieser beiden Faktoren mit Arabidopsis thaliana-Pflanzen zu visualisieren, die kalzium- und glutamatempfindliche fluoreszierende Biosensoren exprimieren.

Abstract

Pflanzen reagieren auf mechanische Belastungen wie Verwundung und Pflanzenfresser, indem sie Abwehrreaktionen sowohl in den beschädigten als auch in den distalen unbeschädigten Teilen hervorrufen. Bei der Verwundung eines Blattes tritt an der Wundstelle ein Anstieg der zytosolischen Calciumionenkonzentration (Ca²⁺ Signal) auf. Dieses Signal wird schnell an unbeschädigte Blätter übertragen, wo Abwehrreaktionen aktiviert werden. Unsere jüngste Forschung ergab, dass Glutamat, das aus den verwundeten Zellen des Blattes in den Apoplasten um sie herum austritt, als Wundsignal dient. Dieses Glutamat aktiviert Glutamatrezeptor-ähnliche Ca²⁺ durchlässige Kanäle, was dann zu einer Fernausbreitung des Ca²⁺ Signals in der gesamten Pflanze führt. Die räumlichen und zeitlichen Eigenschaften dieser Ereignisse können mit Echtzeit-Bildgebung lebender Pflanzen erfasst werden, die genetisch kodierte fluoreszierende Biosensoren exprimieren. Hier stellen wir eine pflanzenweite Echtzeit-Bildgebungsmethode vor, um die Dynamik sowohl der Ca²⁺ Signale als auch Veränderungen des apoplastischen Glutamats, die als Reaktion auf Wunden auftreten, zu überwachen. Dieser Ansatz verwendet ein Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop und transgene Arabidopsis-Pflanzen, die Green Fluorescent Protein (GFP)-basierte Ca²⁺ und Glutamat-Biosensoren exprimieren. Darüber hinaus stellen wir Methoden vor, um eine wundinduzierte, glutamatgesteuerte schnelle und ferngesteuerte Ca²⁺ Signalausbreitung leicht hervorzulösen. Dieses Protokoll kann auch auf Studien zu anderen Pflanzenstress angewendet werden, um zu untersuchen, wie die systemische Signalübertragung von Pflanzen an ihren Signal- und Reaktionsnetzwerken beteiligt sein könnte.

Introduction

Pflanzen können biotischen Belastungen, z. B. Insekten, die sich von ihnen ernähren, nicht entkommen, daher haben sie ausgeklügelte Stresssensor- und Signaltransduktionssysteme entwickelt, um Herausforderungen wie Pflanzenfresser zu erkennen und sich dann vor ihnen zu schützen¹. Bei Verwundung oder Pflanzenfresserangriff initiieren Pflanzen schnelle Abwehrreaktionen, einschließlich der Ansammlung des Phytohormons Jasmonsäure (JA) nicht nur an der verwundeten Stelle, sondern auch in unbeschädigten distalen Organen². Dieses JA löst dann sowohl Abwehrreaktionen in den direkt geschädigten Geweben aus als auch präventiv Abwehrkräfte in den unbeschädigten Teilen der Pflanze. Bei Arabidopsiswurde die durch Wunden induzierte Ansammlung von JA in distalen, intakten Blättern innerhalb weniger Minuten nach Beschädigung an anderer Stelle in der Pflanze nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass ein schnelles und fernweites Signal vom verwundeten Blatt³übertragen wird. Mehrere Kandidaten, wie Ca^2+,reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und elektrische Signale, wurden vorgeschlagen, um als diese Fernwundsignale in Pflanzen^4,5zu dienen.

Ca²⁺ ist eines der vielseitigsten und allgegenwärtigsten zweiten Botenstoffe in eukaryotischen Organismen. Bei Pflanzen verursachen Raupenkauen und mechanische Verwundungen einen drastischen Anstieg der zytosolischen Ca²⁺ Konzentration ([Ca²⁺]_Zyt) sowohl im verwundeten Blatt als auch in ungewickelten entfernten Blättern^6,7. Dieses systemische Ca^2+-Signal wird von intrazellulären^{Ca2+-Sensorproteinen}empfangen, die zur Aktivierung nachgeschalteter Abwehrsignalwege, einschließlich ja-Biosynthese^8,9führen. Trotz zahlreicher solcher Berichte, die die Bedeutung von Ca^2+-Signalen für pflanzliche Wundreaktionen unterstützen, sind Informationen über die räumlichen und zeitlichen Eigenschaften von Ca^2+-Signalen, die durch Verwundung induziert werden, begrenzt.

Die Echtzeitbildgebung mit genetisch kodierten Ca^{2+-Indikatoren} ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Überwachung und Quantifizierung der räumlichen und zeitlichen Dynamik von Ca^2+-Signalen. Bis heute wurden Versionen solcher Sensoren entwickelt, die die Visualisierung von Ca²⁺ Signalen auf der Ebene einer einzelnen Zelle, zu Geweben, Organen und sogar ganzen Pflanzen ermöglichen¹⁰. Der erste genetisch kodierte Biosensor für Ca^2+, der in Pflanzen verwendet wurde, war das biolumineszierende Protein Aequorin, das aus der Qualle Aequorea victoria¹¹gewonnen wurde. Obwohl dieses chemiluminineszierende Protein verwendet wurde, um Ca²⁺ Veränderungen als Reaktion auf verschiedene Spannungen in Pflanzen^12,13,^{14,15,16,17,18}zu erkennen, ist es aufgrund des extrem niedrigen Lumineszenzsignals, das es erzeugt, nicht gut für die Echtzeitbildgebung geeignet. Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-basierte Ca²⁺ Indikatoren, wie die Gelben Kameleons, wurden auch erfolgreich verwendet, um die Dynamik einer Reihe von Ca²⁺ Signalereignissen in Pflanzen^{19,20,21,22,23,24}zu untersuchen. Diese Sensoren sind mit bildgebenden Ansätzen kompatibel und bestehen am häufigsten aus dem Ca^2+-bindenden Protein Calmodulin (CaM) und einem CaM-bindenden Peptid (M13) aus einer Myosin-Leichtkettenkinase, die alle zwischen zwei Fluorophorproteinen verschmolzen sind, im Allgemeinen einem Cyan Fluorescent Protein (CFP) und einer Yellow Fluorescent Protein Variante (YFP)^10. Die Ca^2+-Bindung an CaM fördert die Interaktion zwischen CaM und M13, was zu einer Konformationsänderung des Sensors führt. Diese Änderung fördert die Energieübertragung zwischen CFP und YFP, was die Fluoreszenzintensität des YFP erhöht und gleichzeitig die Fluoreszenzemission der CFP verringert. Die Überwachung dieser Verschiebung von CFP- zu YFP-Fluoreszenz liefert dann ein Maß für den Anstieg des Ca^2+-Niveaus. Zusätzlich zu diesen FRET-Sensoren sind einzelne fluoreszierende Protein (FP)-basierte Ca²⁺ Biosensoren wie GCaMP und R-GECO auch mit pflanzlichen Bildgebungsansätzen kompatibel und werden aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit und Benutzerfreundlichkeit häufig zur Untersuchung von [Ca²⁺]_{-Zytänderungen} verwendet^{25,26,27,28,29,30}. GCaMPs enthalten ein einzelnes zirkulär permutiertes (cp) GFP, das wiederum mit CaM und dem M13-Peptid verschmolzen ist. Die Ca^{2+-abhängige}Wechselwirkung zwischen CaM und M13 bewirkt eine Konformationsänderung im Sensor, die eine Verschiebung des Protonierungszustands des cpGFP fördert und sein fluoreszierendes Signal verstärkt. Wenn also die Ca^2+-Pegel steigen, nimmt das cpGFP-Signal zu.

Um die Dynamik von Ca²⁺ Signalen zu untersuchen, die als Reaktion auf mechanische Verwundung oder Pflanzenfresserfütterung erzeugt werden, haben wir transgene Arabidopsis thaliana Pflanzen verwendet, die eine GCaMP-Variante, GCaMP3, und ein Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop⁶exprimieren. Dieser Ansatz hat es geschafft, die schnelle Übertragung eines Ca 2+-Fernsignals von der Wundstelle auf^einem Blatt auf die gesamte Pflanze zu visualisieren. So wurde sofort ein Anstieg des^[Ca2+]_Zyts an der Wundstelle festgestellt, aber dieses Ca²⁺ Signal wurde dann innerhalb weniger Minuten nach der Verwundung durch das Gefäß durch die benachbarten Blätter verbreitet. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die Übertragung dieses schnellen systemischen Wundsignals in Arabidopsis-Pflanzen mit Mutationen in zwei Glutamatrezeptor-ähnlichen Genen, Glutamatrezeptor-like (GLR), GLR3.3 und GLR3.6⁶, aufgehoben wird. Die GLRs scheinen als aminosäuregesteuerte Ca²⁺ Kanäle zu fungieren, die an verschiedenen physiologischen Prozessen beteiligt sind, einschließlich Wundantwort^3,Pollenröhrenwachstum^31,Wurzelentwicklung^32,Kältereaktion³³und angeborene Immunität³⁴. Trotz dieser gut verstandenen, breiten physiologischen Funktion der GLRs sind Informationen über ihre funktionellen Eigenschaften, wie ihre Ligandenspezifität, Ionenselektivität und subzelluläre Lokalisation, begrenzt³⁵. Neuere Studien berichteten jedoch, dass GLR3.3 und GLR3.6 im Phloem bzw. Xylem lokalisiert sind. Pflanzliche GLRs haben Ähnlichkeiten mit ionotropen Glutamatrezeptoren (iGluRs)³⁶ bei Säugetieren, die durch Aminosäuren wie Glutamat, Glycin und D-Serin im Nervensystem von Säugetieren aktiviert werden³⁷. Tatsächlich haben wir gezeigt, dass die Anwendung von 100 mM Glutamat, aber nicht anderer Aminosäuren, an der Wundstelle ein schnelles, fernförmiges Ca²⁺ Signal in Arabidopsisinduziert, was darauf hindeutet, dass extrazelluläres Glutamat wahrscheinlich als Wundsignal in Pflanzen wirkt⁶. Diese Reaktion wird in der glr3.3/glr3.6-Mutante aufgehoben, was darauf hindeutet, dass Glutamat durch einen oder beide dieser rezeptorähnlichen Kanäle wirken könnte, und tatsächlich wurde kürzlich gezeigt, dass AtGLR3.6 durch diese Glutamatspiegel³⁸eingezäunt wird.

In Pflanzen wurde Glutamat neben seiner Rolle als strukturelle Aminosäure auch als wichtiger Entwicklungsregulator vorgeschlagen³⁹; seine räumliche und zeitliche Dynamik ist jedoch wenig verstanden. Genau wie für Ca²⁺wurden mehrere genetisch kodierte Indikatoren für Glutamat entwickelt, um die Dynamik dieser Aminosäure in lebenden Zellen zu überwachen^40,41. iGluSnFR ist ein GFP-basierter Single-FP-Glutamat-Biosensor, der aus cpGFP und einem Glutamat-bindenden Protein (GltI) aus Escherichia coli^42,43besteht. Die Konformationsänderung von iGluSnFR, die durch Glutamatbindung an GltI induziert wird, führt zu einer verstärkten GFP-Fluoreszenzemission. Um zu untersuchen, ob extrazelluläres Glutamat als Signalmolekül in der pflanzlichen Wundantwort wirkt, haben wir die iGluSnFR-Sequenz mit der grundlegenden Chitinase-Signalpeptidsekretionssequenz (CHIB-iGluSnFR) verbunden, um diesen Biosensor im apoplastischen Raum zu lokalisieren⁶. Dieser Ansatz ermöglichte die Abbildung von Veränderungen der apoplastischen Glutamatkonzentration ([Glu]_apo) mit transgenen Arabidopsis-Pflanzen, die diesen Sensor exprimieren. Wir haben einen schnellen Anstieg des iGluSnFR-Signals an der Wundstelle festgestellt. Diese Daten unterstützen die Idee, dass Glutamat bei der Verwundung aus den beschädigten Zellen / Geweben in den Apoplast austritt und als Schadenssignal wirkt, das die GLRs aktiviert und zum Fernsignal Ca²⁺ in Pflanzen⁶führt.

Hier beschreiben wir ein pflanzenweites Echtzeit-Bildgebungsverfahren mit genetisch kodierten Biosensoren zur Überwachung und Analyse der Dynamik von Fernsignalen von Ca²⁺ und extrazellulärem Glutamat als Reaktion auf Diebstwunden⁶. Die Verfügbarkeit von Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie und transgenen Pflanzen, die genetisch kodierte Biosensoren exprimieren, bietet einen leistungsstarken, aber leicht zu implementierenden Ansatz zur Erkennung schnell übertragener Fernsignale wie Ca²⁺ Wellen.

Protocol

1. Pflanzenmaterialaufbereitung In einer 1,5 ml Mikroröhrchen sterilisieren Sie die Samen der Arabidopsis thaliana (Col-0 Accession) Pflanze, die entweder GCaMP3 oder CHIB-iGluSnFR exprimiert, indem Sie mit 20% (v / v) NaClO für 3 min schütteln und dann 5 mal mit sterilem destilliertem Wasser waschen.HINWEIS: Die transgenen Linien von Arabidopsis, die GCaMP3 oder CHIB-iGluSnFR exprimieren, wurden zuvor beschrieben6. Säen Sie in einer sterilen Haube 13 …

Representative Results

Die Signalausbreitung von [Ca2+]cyt und [Glu]apo als Reaktion auf Wunden ist in Abbildung 3, Abbildung 4, Movie S1und Movie S2dargestellt. Das Schneiden des Blattstiels 1 in Pflanzen, die GCaMP3 (bei 0 s) exprimierten, führte zu einem signifikanten Anstieg des [Ca2+]Zyts, der schnell lokal durch das Gefäß (bei 40 s) induziert wurde (<stron…

Discussion

Systemische Signalisierung ist wichtig für Pflanzen, um auf lokalisierte äußere Umweltreize zu reagieren und dann ihre Homöostase auf einer ganzen Pflanzenebene zu erhalten. Obwohl sie nicht wie Tiere mit einem fortgeschrittenen Nervensystem ausgestattet sind, verwenden sie eine schnelle Kommunikation sowohl innerhalb als auch zwischen Organen, basierend auf Faktoren wie mobilen elektrischen (und möglicherweise hydraulischen) Signalen und sich ausbreitenden Wellen von ROS und Ca^{2 + 46</…}

Materials

Arabidopsis expressing GCaMP3	Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR	Saitama University
GraphPad Prism 7	GraphPad Software
L-Glutamate	FUJIFILM Wako	072-00501	Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel	Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium	FUJIFILM Wako	392-00591	composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope	Nikon
NIS-Elements AR analysis	Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO)	Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2)	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Square plastic Petri dish	Simport	D210-16