वाइड-फील्ड, अरबीडोप्सिस में स्थानीय और प्रणालीगत घाव संकेतों की वास्तविक समय इमेजिंग

Summary

पौधों में यांत्रिक घायल और शाकाहारी हमले के लिए पौधों की रक्षा प्रतिक्रियाओं को शामिल करने के लिए अतिरिक्त ग्लूटामेट-ट्रिगर प्रणालीगत कैल्शियम सिग्नलिंग महत्वपूर्ण है। यह लेख इन दोनों कारकों की स्थानिक और लौकिक गतिशीलता की कल्पना करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है जिसमें कैल्शियम और ग्लूटामेट-सेंसेंट बायोसेंसर व्यक्त किए गए अरबीडोप्सिस थैलियाना पौधों का उपयोग किया जाता है।

Abstract

पौधे क्षतिग्रस्त और डिस्टल अक्षतिग्रस्त हिस्सों में रक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करके घायल और शाकाहारी जैसे यांत्रिक तनावों का जवाब देते हैं। एक पत्ती के घायल होने पर, घाव स्थल पर साइटोसॉलिक कैल्शियम आयन एकाग्रता (सीए^{2 +} सिग्नल) में वृद्धि होती है। यह संकेत तेजी से अक्षतिग्रस्त पत्तियों को प्रेषित किया जाता है, जहां रक्षा प्रतिक्रियाएं सक्रिय होती हैं। हमारे हाल के शोध से पता चला है कि उनके चारों ओर एपोप्लास्ट में पत्ती की घायल कोशिकाओं से लीक ग्लूटामेट एक घाव संकेत के रूप में कार्य करता है । यह ग्लूटामेट ग्लूटामेट रिसेप्टर जैसे सीए^{2 +} पारमेबल चैनलों को सक्रिय करता है, जो तब पूरे संयंत्र में लंबी दूरी की सीए^{2 +} सिग्नल प्रचार की ओर जाता है। इन घटनाओं की स्थानिक और लौकिक विशेषताओं को आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट बायोसेंसर व्यक्त करने वाले जीवित पौधों के वास्तविक समय इमेजिंग के साथ कैप्चर किया जा सकता है। यहां हम सीए^{2 +} संकेतों और घायल होने के जवाब में होने वाले एपोप्लास्टिक ग्लूटामेट में परिवर्तन दोनों की गतिशीलता की निगरानी के लिए एक संयंत्र-चौड़ा, वास्तविक समय इमेजिंग विधि पेश करते हैं। यह दृष्टिकोण ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) आधारित सीए^{2 +} और ग्लूटामेट बायोसेंसर को व्यक्त करने वाले व्यापक क्षेत्र फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप और ट्रांसजेनिक अरबीडोप्सिस पौधों का उपयोग करता है। इसके अलावा, हम आसानी से घाव से प्रेरित, ग्लूटामेट-ट्रिगर रैपिड और लंबी दूरी के सीए^{2 +} सिग्नल प्रचार को प्रकाश में लाने के लिए कार्यप्रणाली पेश करते हैं। इस प्रोटोकॉल को अन्य संयंत्र तनावों पर अध्ययन करने के लिए भी लागू किया जा सकता है ताकि यह जांच करने में मदद मिल सके कि संयंत्र प्रणालीगत सिग्नलिंग उनके सिग्नलिंग और प्रतिक्रिया नेटवर्क में कैसे शामिल हो सकती है।

Introduction

पौधे बायोटिक तनावों से बच नहीं सकते हैं, उदाहरण के लिए, कीड़े उन पर भोजन करते हैं, इसलिए उन्होंने जड़ी-बूटी¹जैसी चुनौतियों से खुद को बचाने के लिए परिष्कृत तनाव संवेदन और सिग्नल ट्रांसडक्शन सिस्टम विकसित किया है। घायल या शाकाहारी हमले पर, पौधे न केवल घायल स्थल पर बल्कि अक्षतिग्रस्त डिस्टल^{अंगों}में भी फाइटोहोरमोन जैस्मोनिक एसिड (जा) के संचय सहित तेजी से रक्षा प्रतिक्रियाएं शुरू करते हैं। यह जा तो दोनों सीधे क्षतिग्रस्त ऊतकों में रक्षा प्रतिक्रियाओं से चलाता है और पहले से संयंत्र के अक्षतिग्रस्त भागों में सुरक्षा लाती है । अरेबिडोप्सिसमें, घायल होने से प्रेरित जा के संचय का पता तब चला, पौधे में कहीं और नुकसान के कुछ ही मिनटों के भीतर बरकरार पत्तियां यह सुझाव देती हैं कि घायल पत्ती³से तेजी से और लंबी दूरी का संकेत प्रेषित किया जा रहा है । सीए^{2 +,}प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) और विद्युत संकेतों जैसे कई उम्मीदवारों को पौधों^{4, 5}में लंबी दूरी के घाव संकेतों के रूप में सेवा करने का प्रस्ताव किया गया है।

Ca^{2 +} यूकेरियोटिक जीवों में सबसे बहुमुखी और सर्वव्यापी दूसरे दूत तत्वों में से एक है। पौधों में, कैटरपिलर चबाने और यांत्रिक रूप से घायल होने से साइटोसोलिक सीए^{2 +} एकाग्रता ([सीए^{2 +]}_{साइट)}दोनों घायल पत्ती में और बिना घाव वाली दूर की पत्तियों में कठोर वृद्धि होती है^6,7। यह प्रणालीगत Ca^{2 +} सिग्नलइंट्रासेलुलर सीए^{2 +}-सेंसिंग प्रोटीन द्वारा प्राप्त होता है, जो एनएए बायोसिंथेसिस^8,9सहित डाउनस्ट्रीम डिफेंस सिग्नलिंग रास्तों को सक्रिय करता है। संयंत्र घाव प्रतिक्रियाओं में सीए^{2 +} संकेतों के महत्व का समर्थन करने वाली कई ऐसी रिपोर्टों के बावजूद, घायल होने से प्रेरित सीए^{2 +} संकेतों की स्थानिक और लौकिक विशेषताओं के बारे में जानकारी सीमित है।

आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए^{2 +} संकेतकों का उपयोग करके वास्तविक समय इमेजिंग सीए 2⁺ संकेतों की स्थानिक और लौकिक गतिशीलता की निगरानी और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। आज तक, ऐसे सेंसरों के संस्करण विकसित किए गए हैं जो एक कोशिका के स्तर पर सीए^{2 +} संकेतों के दृश्य को ऊतकों, अंगों और यहां तक कि पूरे पौधों^{को 10}तक सक्षम करते हैं। पौधों में उपयोग किया जाने वाला सीए^{2 +} के लिए पहला आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर जेलीफिश एक्यूरिया विक्टोरिया¹¹से प्राप्त बायोल्यूमिनसेंट प्रोटीन एइकोरिन था। यद्यपि इस रसायनीय प्रोटीन का उपयोग^{12, 13, 14, 15, 16, 17,18}में विभिन्न तनावों के जवाब में सीए²+ परिवर्तनों का पता लगाने के लिए किया गया है, लेकिन यह बेहद कम ल्यूमिनेसेंट सिग्नल के कारण वास्तविक समय की इमेजिंग के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं है। ^{19,20, 21, 22, 23, 24} में सीए^{2 +} सिग्नलिंग घटनाओं की एक श्रृंखला की घटनाओं की जांच करने के लिए फैस्टर रेकॉन्स एनर्जी ट्रांसफर (FRET) आधारित सीए²+ संकेतकों का भी सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। ये सेंसर इमेजिंग दृष्टिकोणों के साथ संगत होते हैं और आमतौर पर सीए^{2 +} बाध्यकारी प्रोटीन कैलमोडुलिन (सीएएम) और एक मायोसिन लाइट चेन किनेज़ से सीएएम-बाइंडिंग पेप्टाइड (एम13) से बने होते हैं, सभी दो फ्लोरोफोर प्रोटीन के बीच जुड़े होते हैं, आम तौर पर एक सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (CFP) और एक पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन संस्करण (वाईएफपी)^10। Ca^{2 +} CaM के लिए बाध्यकारी CaM और M13 के बीच बातचीत को बढ़ावा देता है जिससे सेंसर का एक अनुरूप परिवर्तन होता है। यह बदलाव सीएफपी और वाईएफपी के बीच ऊर्जा हस्तांतरण को बढ़ावा देता है, जो सीएफपी से फ्लोरेसेंस उत्सर्जन को कम करते हुए वाईएफपी की फ्लोरेसेंस तीव्रता को बढ़ाता है । सीएफपी से वाईएफपी फ्लोरेसेंस तक इस बदलाव की निगरानी करना सीए^{2 +} स्तर में वृद्धि का एक उपाय प्रदान करता है। इन FRET सेंसरों के अलावा, एकल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) आधारित सीए^{2 +} बायोसेंसर, जैसे कि जीसीएएमपी और आर-जीईसीओ, पौधों के इमेजिंग दृष्टिकोणों के साथ भी संगत हैं और उनकी उच्च संवेदनशीलता और उपयोग में आसानी के कारण [सीए^{2 +}]_साइट परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है^{25,26,27, 28,29,30।} GCaMPs में एक गोलाकार रूप से क्रमबद्ध (सीपी) जीएफपी होता है, जो फिर से सीएएम और एम13 पेप्टाइड से जुड़ा होता है। Ca²+-CaM और M13 के बीच निर्भर बातचीत सेंसर में एक अनुरूप परिवर्तन का कारण बनता है कि cpGFP के प्रोटोनेशन राज्य में बदलाव को बढ़ावा देता है, अपने फ्लोरोसेंट संकेत को बढ़ाने । इस प्रकार, सीए^{2 +} स्तर बढ़ने के साथ, सीपीजीएफपी सिग्नल बढ़ जाता है।

यांत्रिक घायल या शाकाहारी भोजन के जवाब में उत्पन्न सीए^{2 +} संकेतों की गतिशीलता की जांच करने के लिए, हमने ट्रांसजेनिक अरबीडोप्सिस थैलियाना पौधों का उपयोग किया है जो जीसीएएमपी संस्करण, जीसीएएमपी 3 और एक व्यापक क्षेत्र फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप⁶व्यक्त करते हैं। यह दृष्टिकोण घाव स्थल से पूरे पौधे तक एक लंबी दूरी के सीए^{2 +} सिग्नल के तेजी से संचरण की कल्पना करने में सफल रहा है। इस प्रकार, घाव स्थल पर [सीए^{2 +]}_साइट में वृद्धि का तुरंत पता चला लेकिन इस सीए^{2 +} सिग्नल को घायल होने के कुछ मिनटों के भीतर वेक्यूलेचर के माध्यम से पड़ोसी पत्तियों में प्रचारित किया गया। इसके अलावा, हमने पाया कि इस तेजी से प्रणालीगत घाव संकेत का संचरण अरबीडोप्सिस पौधों में समाप्त हो जाता है, जिसमें दो ग्लूटामेट रिसेप्टर जैसे जीन, ग्लूटामेट रिसेप्टर जैसे (जीएलआर), जीएलआर 3.3 और जीएलआर 3.6 6में म्यूटेशन होते हैं। जीएलआर विभिन्न शारीरिक प्रक्रियाओं में शामिल अमीनो-एसिड गेटेड सीए^{2 +} चैनलों के रूप में कार्य करता दिखाई देता है, जिसमें घाव प्रतिक्रिया^3,पराग ट्यूब विकास^31,रूट विकास^32,कोल्ड रिस्पांस³³और जन्मजात प्रतिरक्षा³⁴शामिल हैं। जीएलआर के इस अच्छी तरह से समझे जाने वाले, व्यापक शारीरिक कार्य के बावजूद, उनके कार्यात्मक गुणों के बारे में जानकारी, जैसे कि उनकी लिगांड विशिष्टता, आयन चयनशीलता, और उपकोशिकीय स्थानीयकरण,^{सीमित 35}हैं। हालांकि, हाल के अध्ययनों ने बताया कि GLR3.3 और GLR3.6 क्रमशः phloem और दारू में स्थानीयकृत हैं । पौधे जीएलआर में स्तनधारियों में आयनोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर्स (आईजीएलआर)³⁶ में समानताएं हैं, जो स्तनधारी तंत्रिका तंत्र³⁷में ग्लूटामेट, ग्लाइसिन और डी-सेरीन जैसे अमीनो एसिड द्वारा सक्रिय होती हैं। दरअसल, हमने दिखा दिया कि घाव स्थल पर 100 mM ग्लूटामेट का आवेदन, लेकिन अन्य अमीनो एसिड नहीं, अरबीडोप्सिसमें तेजी से, लंबी दूरी की सीए^{2 +} सिग्नल को प्रेरित करता है, यह दर्शाता है कि बाह्राश ग्लूटामेट की संभावना पौधों में घाव संकेत के रूप में कार्य करती है^6। इस प्रतिक्रिया को glr3.3/glr3.6उत्परिवर्ती में समाप्त कर दिया गया है, जिसमें यह सुझाव दिया गया है कि ग्लूटामेट इन रिसेप्टर जैसे चैनलों में से एक या दोनों के माध्यम से कार्य कर सकता है और वास्तव में, ATGLR3.6 को हाल ही में ग्लूटामेट^३८के इन स्तरों से गेट किया जाना दिखाया गया था ।

पौधों में, एक संरचनात्मक अमीनो एसिड के रूप में अपनी भूमिका के अलावा, ग्लूटामेट को एक प्रमुख विकास नियामक³⁹के रूप में भी प्रस्तावित किया गया है; हालांकि, इसकी स्थानिक और लौकिक गतिशीलता खराब समझ में आती है। सीए^{2 +}के लिए, जीवित कोशिकाओं में इस अमीनो एसिड की गतिशीलता की निगरानी के लिए ग्लूटामेट के लिए कई आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड संकेतक विकसित किए गए^हैं। iGluSnFR एक जीएफपी आधारित एकल-एफपी ग्लूटामेट बायोसेंसर है जो सीपीजीएफपी से बना है और एस्चेरिचिया कोलाई^{42, 43}से ग्लूटामेट बाइंडिंग प्रोटीन (ग्लटीआई) है। IGluSnFR का अनुरूप परिवर्तन, जो ग्लूटामेट द्वारा जीएलटीआई के लिए बाध्यकारी द्वारा प्रेरित होता है, जिसके परिणामस्वरूप जीएफपी फ्लोरेसेंस उत्सर्जन में वृद्धि होती है। यह जांचने के लिए कि क्या एक्सासेलुलर ग्लूटामेट पौधे के घाव की प्रतिक्रिया में एक सिग्नलिंग अणु के रूप में कार्य करता है, हमने एपोप्लास्टिक स्पेस⁶में इस बायोसेंसर को स्थानीयकृत करने के लिए बुनियादी चिटनेस सिग्नल पेप्टाइड स्राव अनुक्रम (CHIB-iGluSnFR) के साथ iGluSnFR अनुक्रम को जोड़ा। इस दृष्टिकोण ने इस सेंसर को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक अरबीडोप्सिस पौधों का उपयोग करके एपोप्लास्टिक ग्लूटामेट एकाग्रता ([ग्लू]_{एपीओ)}में किसी भी परिवर्तन की इमेजिंग को सक्षम किया। हमने घायल स्थल पर iGluSnFR सिग्नल में तेजी से वृद्धि का पता लगाया। यह डेटा इस विचार का समर्थन करता है कि ग्लूटामेट क्षतिग्रस्त कोशिकाओं/ऊतकों से घायल होने पर एपोप्लास्ट में लीक हो जाता है और जीएलआर को सक्रिय करने के लिए क्षति संकेत के रूप में कार्य करता है और पौधों में लंबी दूरी की सीए^{2 +} सिग्नल के लिए अग्रणी⁶।

यहां, हम⁶घायल होने के जवाब में लंबी दूरी की सीए^{2 +} और बाह्राशील ग्लूटामेट संकेतों की गतिशीलता की निगरानी और विश्लेषण करने के लिए आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर का उपयोग करके एक संयंत्र-व्यापी वास्तविक समय इमेजिंग विधि का वर्णन करते हैं। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर व्यक्त करने वाले व्यापक क्षेत्र फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और ट्रांसजेनिक पौधों की उपलब्धता सीए^{2 +} तरंगों जैसे तेजी से संचारित लंबी दूरी के संकेतों का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली, अभी तक आसानी से लागू दृष्टिकोण प्रदान करती है।

Protocol

1. पौधे सामग्री तैयार करने एक 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में, सतह अरबीडोप्सिस थैलियाना (कर्नल-0 परिग्रहण) संयंत्र के बीजों को 3 मिनट के लिए 20% (v/v) NaClO के साथ मिलाते हुए GCaMP3 या CHIB-iGluSnFR व्यक्त करने और फिर बाँझ आसुत प?…

Representative Results

घायल होने के जवाब में [सीए2+]साइट और [ग्लू]एपीओ का सिग्नल प्रचार चित्र 3, चित्रा 4, मूवी एस 1और मूवी एस 2में प्रस्तुत किया गया है । GCaMP3 (0 एस पर) व्यक्त ?…

Discussion

पौधों के लिए स्थानीयकृत बाहरी पर्यावरणीय उत्तेजनाओं का जवाब देने और फिर पूरे पौधे के स्तर पर अपने होमोस्टेसिस को बनाए रखने के लिए प्रणालीगत संकेत महत्वपूर्ण है। यद्यपि वे जानवरों की तरह उन्नत तंत्रि…

Materials

Arabidopsis expressing GCaMP3	Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR	Saitama University
GraphPad Prism 7	GraphPad Software
L-Glutamate	FUJIFILM Wako	072-00501	Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel	Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium	FUJIFILM Wako	392-00591	composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope	Nikon
NIS-Elements AR analysis	Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO)	Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2)	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Square plastic Petri dish	Simport	D210-16