Wide-Field, sanntidsavbildning av lokale og systemiske sårsignaler i Arabidopsis

Summary

Ekstracellulær glutamatutløst systemisk kalsiumsignalering er avgjørende for induksjon av planteforsvarsresponser på mekanisk såring og plantelevende angrep i planter. Denne artikkelen beskriver en metode for å visualisere den romlige og tidsmessige dynamikken i begge disse faktorene ved hjelp av Arabidopsis thaliana planter som uttrykker kalsium- og glutamatfølsomme fluorescerende biosensorer.

Abstract

Planter reagerer på mekaniske påkjenninger som sår og plantelevende ved å indusere forsvarsresponser både i de skadede og i de distale uskadede delene. Ved såring av et blad oppstår en økning i cytosolisk kalsiumionkonsentrasjon (Ca^{2 +} signal) på sårstedet. Dette signalet overføres raskt til uskadede blader, hvor forsvarsresponser aktiveres. Vår nylige forskning viste at glutamat som lekker fra de sårede cellene i bladet inn i apoplasten rundt dem, fungerer som et sårsignal. Dette glutamatet aktiverer glutamatreseptorlignende Ca²⁺ gjennomtrengelige kanaler, noe som deretter fører til langdistanse Ca^{2 +} signalutbredelse i hele anlegget. De romlige og tidsmessige egenskapene til disse hendelsene kan fanges opp med sanntidsavbildning av levende planter som uttrykker genetisk kodede fluorescerende biosensorer. Her introduserer vi en planteomfattende bildemetode i sanntid for å overvåke dynamikken i både Ca²⁺ -signalene og endringer i apoplastisk glutamat som oppstår som respons på sår. Denne tilnærmingen bruker et bredfelts fluorescensmikroskop og transgene Arabidopsis-planter som uttrykker Green Fluorescent Protein (GFP)-baserte Ca²⁺ og glutamatbiosensorer. I tillegg presenterer vi metodikk for enkelt å fremkalle sårindusert, glutamatutløst rask og langdistanse Ca²⁺ signalutbredelse. Denne protokollen kan også brukes på studier på andre plantespenninger for å bidra til å undersøke hvordan plantesystemisk signalering kan være involvert i deres signal- og responsnettverk.

Introduction

Planter kan ikke unnslippe biotiske påkjenninger, for eksempel insekter som fôrer på dem, så de har utviklet sofistikerte stresssensor- og signaltransduksjonssystemer for å oppdage og deretter beskytte seg mot utfordringer som plantelevende¹. Ved sår eller plantelevende angrep starter planter raske forsvarsresponser, inkludert opphopning av fytohormonet jasmonsyre (JA) ikke bare på det sårede stedet, men også i uskadede distale organer². Denne JA utløser deretter begge forsvarsresponser i det direkte skadede vevet og induserer fortrinnsrett forsvar i de uskadede delene av anlegget. I Arabidopsisble akkumuleringen av JA indusert av sår oppdaget i distale, intakte blader innen bare noen få minutter etter skade andre steder i anlegget, noe som tyder på at et raskt og langdistansesignal overføres fra det sårede bladet³. Flere kandidater, som Ca²⁺, reaktive oksygenarter (ROS) og elektriske signaler, har blitt foreslått å tjene som disse langdistanse sårsignalene i anlegg^4,5.

Ca²⁺ er et av de mest allsidige og allestedsnærværende andre messenger-elementene i eukaryote organismer. I planter forårsaker larve tygge og mekanisk såring drastiske økninger i cytosoliske Ca^{2 +} konsentrasjon ([Ca^{2 +}]_cyt) både i det sårede bladet og i viklet fjerne blader^6,7. Dette systemiske Ca²⁺ -signalet mottas av intracellulære Ca²⁺-sensing proteiner, noe som fører til aktivering av nedstrøms forsvarssignalveier, inkludert JA biosyntese^8,9. Til tross for mange slike rapporter som støtter viktigheten av Ca^{2 +} -signaler i plantesårresponser, er informasjon om de romlige og tidsmessige egenskapene til Ca^{2 +} -signaler forårsaket av sår begrenset.

Sanntidsavbildning ved hjelp av genetisk kodede Ca^{2+-indikatorer} er et kraftig verktøy for å overvåke og kvantifisere romlig og tidsmessig dynamikk i Ca^2+-signaler. Til dags dato er det utviklet versjoner av slike sensorer som muliggjør visualisering av Ca^{2 +} -signaler på nivået av en enkelt celle, til vev, organer og til og med hele planter¹⁰. Den første genetisk kodede biosensoren for Ca^{2 +} brukt i planter var bioluminescent protein aequorin avledet fra maneter Aequorea victoria¹¹. Selv om dette chemiluminescent proteinet har blitt brukt til å oppdage Ca^{2 +} endringer som svar på ulike belastninger i planter^{12,13,14,15,16,17,18}, er det ikke godt egnet for sanntidsavbildning på grunn av det ekstremt lave luminescerende signalet det produserer. Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-baserte Ca²⁺ indikatorer, for eksempel de gule kamelonene, har også blitt brukt til å undersøke dynamikken i en rekke Ca²⁺ signalhendelser i anlegg^{19,20,21,22,23,24}. Disse sensorene er kompatible med bildemetoder og består oftest av Ca²⁺ bindende protein calmodulin (CaM) og et CaM-bindende peptid (M13) fra en myosinlyskjedekinase, alle smeltet sammen mellom to fluoroforproteiner, vanligvis et cyan fluorescerende protein (CFP) og en Gul fluorescerende proteinvariant (YFP)¹⁰. Ca²⁺ binding til CaM fremmer samspillet mellom CaM og M13 som fører til en konformasjonsendring av sensoren. Denne endringen fremmer energioverføring mellom CFP og YFP, noe som øker fluorescensintensiteten til YFP samtidig som fluorescensutslippet reduseres fra CFP. Overvåking av dette skiftet fra CFP til YFP fluorescens gir deretter et mål på økningen i Ca^{2 +} nivå. I tillegg til disse FRET-sensorene er enkelt fluorescerende protein (FP)-baserte Ca²⁺ biosensorer, som GCaMP og R-GECO, også kompatible med planteavbildningsmetoder og er mye brukt til å studere [Ca^{2 +}]_cytendringer på grunn av deres høye følsomhet og brukervennlighet^{25,26,27,28,29,30}. GCaMPs inneholder en enkelt sirkulær permutert (cp) GFP, igjen smeltet sammen til CaM og M13 peptid. Ca²⁺-avhengig interaksjon mellom CaM og M13 forårsaker en konformasjonsendring i sensoren som fremmer et skifte i protonasjonstilstanden til cpGFP, noe som forbedrer fluorescerende signal. Dermed, når Ca^{2 +} nivåer stiger, øker cpGFP-signalet.

For å undersøke dynamikken i Ca^{2 +} -signaler generert som svar på mekanisk såring eller plantelevende fôring, har vi brukt transgene Arabidopsis thaliana-planter som uttrykker en GCaMP-variant, GCaMP3 og et bredfelts fluorescensmikroskop⁶. Denne tilnærmingen har lyktes i å visualisere rask overføring av et langdistanse Ca^{2 +} -signal fra sårstedet på et blad til hele planten. Dermed ble en økning i [Ca^{2 +}]_cyt umiddelbart oppdaget på sårstedet, men dette Ca^{2 +} -signalet ble deretter forplantet til nabobladene gjennom vaskulaturen innen få minutter etter sår. Videre fant vi ut at overføringen av dette raske systemiske sårsignalet avskaffes i Arabidopsis planter med mutasjoner i to glutamatreseptorlignende gener, Glutamatreseptor som (GLR), GLR3.3 og GLR3.6⁶. GLR-ene ser ut til å fungere som aminosyre inngjerdede Ca^{2 +} kanaler involvert i forskjellige fysiologiske prosesser, inkludert sårrespons³, pollenrørvekst³¹, rotutvikling³², kaldrespons³³og medfødt immunitet³⁴. Til tross for denne godt forståtte, brede fysiologiske funksjonen til GLRs, er informasjon om deres funksjonelle egenskaper, for eksempel deres ligand spesifisitet, ion selectivity og subcellulær lokalisering, begrenset³⁵. Nyere studier rapporterte imidlertid at GLR3.3 og GLR3.6 er lokalisert i henholdsvis phloem og xylem. PlanteglRs har likheter med ionotrope glutamatreseptorer (iGluRs)³⁶ hos pattedyr, som aktiveres av aminosyrer, som glutamat, glycin og D-serin i pattedyrnervesystemet³⁷. Faktisk viste vi at anvendelsen av 100 mM glutamat, men ikke andre aminosyrer, på sårstedet induserer et raskt, langdistanse Ca^{2 +} signal i Arabidopsis, noe som indikerer at ekstracellulær glutamat sannsynligvis fungerer som et sårsignal i planter⁶. Dette svaret er avskaffet i glr3.3/glr3.6 mutant som antyder at glutamat kan virke gjennom en eller begge disse reseptorlignende kanalene, og faktisk ble AtGLR3.6 nylig vist seg å være inngjerdet av disse nivåene av glutamat³⁸.

I planter, i tillegg til sin rolle som en strukturell aminosyre, har glutamat også blitt foreslått som en viktig utviklingsregulator³⁹; Imidlertid er dens romlige og tidsmessige dynamikk dårlig forstått. Akkurat som for Ca^{2 +}, flere genetisk kodede indikatorer for glutamat er utviklet for å overvåke dynamikken i denne aminosyren i levende celler^40,41. iGluSnFR er en GFP-basert enkelt-FP glutamat biosensor sammensatt av cpGFP og et glutamatbindingsprotein (GltI) fra Escherichia coli^42,43. Konformasjonsendringen av iGluSnFR, som induseres av glutamatbinding til GltI, resulterer i et forbedret GFP-fluorescensutslipp. For å undersøke om ekstracellulært glutamat fungerer som et signalmolekyl i plantesårrespons, koblet vi iGluSnFR-sekvensen med den grunnleggende chitinase signalpeptidsekresjonssekvensen (CHIB-iGluSnFR) for å lokalisere denne biosensoren i det apoplastiske rommet⁶. Denne tilnærmingen gjorde det mulig å avbilde eventuelle endringer i den apoplastiske glutamatkonsentrasjonen ([Glu]_apo) ved hjelp av transgene Arabidopsis-planter som uttrykker denne sensoren. Vi oppdaget raske økninger i iGluSnFR-signalet på sårstedet. Disse dataene støtter ideen om at glutamat lekker ut av de skadede cellene / vevene til apoplasten ved såring og fungerer som et skadesignal som aktiverer GLR-ene og fører til langdistanse Ca^{2 +} -signalet i plante⁶.

Her beskriver vi en planteomfattende sanntidsavbildningsmetode ved hjelp av genetisk kodede biosensorer for å overvåke og analysere dynamikken i langdistanse Ca^{2 +} og ekstracellulære glutamatsignaler som svar på^{såring 6}. Tilgjengeligheten av bredfelts fluorescensmikroskopi og transgene planter som uttrykker genetisk kodede biosensorer gir en kraftig, men likevel lett implementert tilnærming for å oppdage raskt overførte langdistansesignaler, for eksempel Ca^{2 +} bølger.

Protocol

1. Forberedelse av plantemateriale I en 1,5 ml mikrotube steriliserer overflaten frøene til Arabidopsis thaliana (Col-0 tiltredelse) som uttrykker enten GCaMP3 eller CHIB-iGluSnFR ved å riste med 20% (v / v) NaClO i 3 minutter og vask deretter 5 ganger med sterilt destillert vann.MERK: De transgene linjene til Arabidopsis som uttrykker GCaMP3 eller CHIB-iGluSnFR har blitt beskrevet tidligere6. I en steril hette, så 13 overflatesteriliserte frø på en 1…

Representative Results

Signalutbredelse av [Ca2+]cyt og [Glu]apo som svar på sår er presentert i figur 3, figur 4, film S1og film S2. Kutting av bladbladets petiole 1 i planter som uttrykker GCaMP3 (ved 0 s) førte til en betydelig økning i [Ca2+]cyt som raskt ble indusert lokalt gjennom vaskulaturen (ved 40 s) (Figur 3 og F…

Discussion

Systemisk signalering er viktig for planter å reagere på lokaliserte eksterne miljøstimuli og deretter opprettholde sin homeostase på et helt plantenivå. Selv om de ikke er utstyrt med et avansert nervesystem som dyr, bruker de rask kommunikasjon både i og mellom organer basert på faktorer som mobile elektriske (og muligens hydrauliske) signaler og forplantningsbølger av ROS og Ca^{2 + 46,47}. Protokollen beskrevet ovenfor tillater planteomfatten…

Materials

Arabidopsis expressing GCaMP3	Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR	Saitama University
GraphPad Prism 7	GraphPad Software
L-Glutamate	FUJIFILM Wako	072-00501	Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel	Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium	FUJIFILM Wako	392-00591	composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope	Nikon
NIS-Elements AR analysis	Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO)	Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2)	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Square plastic Petri dish	Simport	D210-16