Imagens em campo amplo e em tempo real de sinais de feridas locais e sistêmicas em Arabidopsis

Summary

A sinalização sistêmica de cálcio acionada por glutamato extracelular é fundamental para a indução de respostas de defesa vegetal a ferimentos mecânicos e ataque herbívoro em plantas. Este artigo descreve um método para visualizar a dinâmica espacial e temporal de ambos os fatores usando plantas arabidopsis thaliana expressando biosensores fluorescentes sensíveis ao cálcio e glutamato.

Abstract

As plantas respondem a tensões mecânicas, como ferimentos e herbívoros, induzindo respostas de defesa tanto nas partes danificadas quanto nas partes distais não danificadas. Após o ferimento de uma folha, ocorre um aumento na concentração de íons de cálcio citosos (sinal ca²⁺⁾ no local da ferida. Este sinal é rapidamente transmitido para folhas não danificadas, onde as respostas de defesa são ativadas. Nossa pesquisa recente revelou que o glutamato vazando das células feridas da folha para o apoplasto ao seu redor serve como um sinal de ferimento. Este glutamato ativa os canais permeáveis ca²⁺ semelhantes ao receptor de glutamato, o que leva à propagação de sinal Ca²⁺ de longa distância em toda a planta. As características espaciais e temporais desses eventos podem ser capturadas com imagens em tempo real de plantas vivas expressando biosensores fluorescentes geneticamente codificados. Aqui introduzimos um método de imagem em tempo real em toda a planta para monitorar a dinâmica dos sinais ca²⁺ e mudanças no glutamato apoplástico que ocorrem em resposta ao ferimento. Esta abordagem usa um microscópio de fluorescência de campo largo e plantas de Arabidopsis transgênicas expressando Ca²⁺ à base de Proteína Fluorescente Verde (GFP) e biosensores de glutamato. Além disso, apresentamos metodologia para facilmente provocar a propagação de sinal Ca²⁺ induzida por feridas e glutamato. Este protocolo também pode ser aplicado a estudos sobre outras estações vegetais para ajudar a investigar como a sinalização sistêmica da planta pode estar envolvida em suas redes de sinalização e resposta.

Introduction

As plantas não podem escapar de estresses bióticos, por exemplo, insetos que se alimentam deles, por isso desenvolveram sofisticados sistemas de sensoriamento de estresse e transdução de sinais para detectar e, em seguida, proteger-se de desafios como herbívoro¹. Ao ferir ou atacar herbívoros, as plantas iniciam respostas rápidas de defesa, incluindo o acúmulo do ácido jasmônico fitohormônio (JA) não apenas no local ferido, mas também em órgãos distais não danificados². Este JA então ambos desencadeiam respostas de defesa nos tecidos diretamente danificados e induz preventivamente defesas nas partes não danificadas da planta. Em Arabidopsis, o acúmulo de JA induzido pelo ferimento foi detectado em folhas distais e intactas em apenas alguns minutos de danos em outros lugares da planta sugerindo que um sinal rápido e de longa distância está sendo transmitido da folha³ferida . Vários candidatos, como ca^2+,espécies reativas de oxigênio (ROS) e sinais elétricos, foram propostos para servir como esses sinais de ferida de longa distância nas plantas^4,5.

Ca²⁺ é um dos mais versáteis e onipresentes segundo elementos mensageiros em organismos eucarióticos. Nas plantas, a mastigação de lagartas e o ferimento mecânico causam aumentos drásticos na concentração citosolic Ca²⁺ ([Ca²⁺]_cyt) tanto na folha ferida quanto em folhas distantes desenroladas^6,7. Este sinal sistêmico Ca²⁺ é recebido por proteínas de sensoriamento intracelular Ca^2+,que levam à ativação de vias de sinalização de defesa a jusante, incluindo a biossíntese JA^8,9. Apesar de inúmeros desses relatos que sustentam a importância dos sinais de Ca²⁺ nas respostas de feridas vegetais, as informações sobre as características espaciais e temporais dos sinais Ca²⁺ induzidos pelo ferimento são limitadas.

A imagem em tempo real usando indicadores Ca²⁺ geneticamente codificados é uma ferramenta poderosa para monitorar e quantificar a dinâmica espacial e temporal dos sinais Ca^2+. Até o momento, foram desenvolvidas versões desses sensores que permitem a visualização de sinais ca²⁺ ao nível de uma única célula, para tecidos, órgãos e até plantas inteiras¹⁰. O primeiro biosensor geneticamente codificado para Ca²⁺ usado em plantas foi a proteína bioluminescente aequorin derivada da água-viva Aequorea victoria¹¹. Embora esta proteína quemiluminescente tenha sido usada para detectar alterações de Ca²⁺ em resposta a várias tensões nas plantas^{12,13,14,15,16,17,18}, não é adequada para imagens em tempo real devido ao sinal extremamente baixo luminescente que produz. Os indicadores Ca²⁺ baseados em Förster Resonance Energy Transfer (FRET), como os cameleons Amarelos, também foram usados com sucesso para investigar a dinâmica de uma gama de eventos de sinalização Ca²⁺ nas usinas^{19,20,21,22,23,24}. Estes sensores são compatíveis com abordagens de imagem e, mais comumente, são compostos pela proteína de ligação Ca²⁺ calmodulin (CaM) e um peptídeo de ligação de CaM (M13) de uma quinase da cadeia de luz da miosina, tudo fundido entre duas proteínas fluorforas, geralmente uma Proteína Fluorescente Cyan (CFP) e uma variante de Proteína Fluorescente Amarela (YFP)¹⁰. A ligação Ca²⁺ ao CaM promove a interação entre CaM e M13 levando a uma mudança conformacional do sensor. Essa mudança promove a transferência de energia entre o PCP e o YFP, o que aumenta a intensidade da fluorescência do YFP, diminuindo a emissão de fluorescência do PCP. O monitoramento dessa mudança de CFP para fluorescência YFP fornece então uma medida do aumento do nível Ca^2+. Além desses sensores FRET, biosensores ca²⁺ baseados em proteína única (FP) como GCaMP e R-GECO, também são compatíveis com abordagens de imagem vegetal e são amplamente utilizados para estudar as alterações_{de citos} [Ca²⁺] devido à sua alta sensibilidade e facilidade de uso^{25,26,27,28,29,30}. Os GCaMPs contêm um único GFP circularmente permutado (cp), novamente fundido ao CaM e ao peptídeo M13. A interação dependente de Ca²⁺entre CaM e M13 provoca uma mudança conformacional no sensor que promove uma mudança no estado de protonação do cpGFP, aumentando seu sinal fluorescente. Assim, à medida que os níveis de Ca²⁺ aumentam, o sinal cpGFP aumenta.

Para investigar a dinâmica dos sinais ca²⁺ gerados em resposta a ferimentos mecânicos ou alimentação herbívora, utilizamos plantas transgênicas arabidopsis thaliana expressando uma variante GCaMP, GCaMP3, e um microscópio de fluorescência de campo largo⁶. Esta abordagem conseguiu visualizar a transmissão rápida de um sinal Ca²⁺ de longa distância do local da ferida em uma folha para toda a planta. Assim, um aumento no_cite [Ca²⁺] foi imediatamente detectado no local da ferida, mas este sinal Ca²⁺ foi então propagado para as folhas vizinhas através da vasculatura poucos minutos após o ferimento. Além disso, descobrimos que a transmissão desse sinal de ferida sistêmica rápida é abolida em plantas arabidopsis com mutações em dois genes semelhantes a receptores de glutamato, Glutamato Receptor Like (GLR), GLR3.3 e GLR3.6⁶. Os GLRs parecem funcionar como canais de aminoácidos fechados Ca²⁺ envolvidos em diversos processos fisiológicos, incluindo resposta à ferida^3,crescimento do tubo de pólen^31,desenvolvimento raiz^32,resposta fria³³e imunidade inata³⁴. Apesar dessa função fisiológica bem compreendida e ampla das GLRs, as informações sobre suas propriedades funcionais, como sua especificidade de ligante, seletividade de íons e localização subcelular, são limitadas³⁵. No entanto, estudos recentes relataram que GLR3.3 e GLR3.6 estão localizados nos phloem e xilem, respectivamente. As GLRs vegetais têm semelhanças com receptores de glutamato ionotrópicos (iGluRs)³⁶ em mamíferos, que são ativados por aminoácidos, como glutamato, glicina e D-serina no sistema nervoso mamífero³⁷. De fato, demonstramos que a aplicação de glutamato de 100 mM, mas não outros aminoácidos, no local da ferida induz um sinal ca²⁺ rápido e de longa distância em Arabidopsis,indicando que o glutamato extracelular provavelmente age como sinal de ferida nas plantas⁶. Esta resposta é abolida no mutante glr3.3/glr3.6 sugerindo que o glutamato pode estar agindo através de um ou ambos esses canais semelhantes a receptores e, de fato, o AtGLR3.6 foi recentemente mostrado como fechado por esses níveis de glutamato³⁸.

Nas plantas, além de seu papel como aminoácido estrutural, o glutamato também foi proposto como um importante regulador de desenvolvimento³⁹; no entanto, sua dinâmica espacial e temporal são mal compreendidas. Assim como no Ca²⁺, vários indicadores geneticamente codificados para glutamato foram desenvolvidos para monitorar a dinâmica deste aminoácido em células vivas^40,41. IGluSnFR é um biosensor de glutamato uni FP baseado em GFP composto por cpGFP e uma proteína de ligação de glutamato (GLT) da Escherichia coli^42,43. A mudança conformacional do iGluSnFR, que é induzido pela ligação de glutamato ao GLI, resulta em uma emissão de fluorescência GFP aprimorada. Para investigar se o glutamato extracelular age como uma molécula de sinalização na resposta à ferida vegetal, conectamos a sequência iGluSnFR com a sequência básica de secreção de peptídeo de sinal de chitinase (CHIB-iGluSnFR) para localizar esse biosensor no espaço apoplásico⁶. Esta abordagem permitiu a imagem de quaisquer alterações na concentração de glutamato apoplástico ([Glu]_apo) usando plantas de Arabidopsis transgênicas expressando este sensor. Detectamos aumentos rápidos no sinal iGluSnFR no local do ferimento. Esses dados apoiam a ideia de que o glutamato vaza das células/tecidos danificados para o apoplasto ao ferimento e age como um sinal de dano ativando as GLRs e levando ao sinal Ca²⁺ de longa distância nas plantas⁶.

Aqui, descrevemos um método de imagem em tempo real em toda a planta usando biosensores geneticamente codificados para monitorar e analisar a dinâmica dos sinais de glutamato Ca²⁺ de longa distância e extracelulares em resposta ao ferimento⁶. A disponibilidade de microscopia de fluorescência de campo amplo e plantas transgênicas expressando biosensores geneticamente codificados fornece uma abordagem poderosa, mas facilmente implementada para detectar sinais de longa distância rapidamente transmitidos, como ondas ca^2+.

Protocol

1. Preparação do material vegetal Em um microtubo de 1,5 mL, a superfície esteriliza as sementes de Arabidopsis thaliana (adesão Col-0) expressando gCaMP3 ou CHIB-iGluSnFR tremendo com 20% (v/v) NaClO por 3 min e depois lave 5 vezes com água destilada estéril.NOTA: As linhas transgênicas de Arabidopsis expressando GCaMP3 ou CHIB-iGluSnFR foram descritas anteriormente6. Em um capô estéril, semeear 13 sementes esterilizadas pela superfície em uma p…

Representative Results

A propagação de sinais de [Ca2+]cyt e [Glu]apo em resposta ao ferimento é apresentada na Figura 3, Figura 4, Filme S1e Filme S2. Cortar a petiola da folha 1 em plantas expressando GCaMP3 (em 0 s) levou a um aumento significativo nocite [Ca2+] que foi rapidamente induzido localmente através da vasculatura (aos 40 s) (F…

Discussion

A sinalização sistêmica é importante para que as plantas respondam a estímulos ambientais externos localizados e, em seguida, mantenham sua homeostase em todo o nível da planta. Embora não estejam equipados com um sistema nervoso avançado como animais, eles empregam comunicação rápida dentro e entre órgãos com base em fatores como sinais elétricos móveis (e possivelmente hidráulicos) e ondas propagadoras de ROS e Ca^2+ 46,47. O protocol…

Materials

Arabidopsis expressing GCaMP3	Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR	Saitama University
GraphPad Prism 7	GraphPad Software
L-Glutamate	FUJIFILM Wako	072-00501	Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel	Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium	FUJIFILM Wako	392-00591	composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope	Nikon
NIS-Elements AR analysis	Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO)	Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2)	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Square plastic Petri dish	Simport	D210-16