Bewertung von Proteininteraktionen in lebenden Zellen mit FRET-sensibilisierter Emission
Summary
Der Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET) zwischen zwei Fluorophor-Molekülen kann zur Untersuchung von Proteininteraktionen in der lebenden Zelle verwendet werden. Hier wird ein Protokoll zur Verfügung gestellt, wie FRET in lebenden Zellen gemessen werden kann, indem die sensibilisierte Emission des Akzeptors und das Abschrecken des Donormoleküls mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie detektiert werden.
Abstract
Der Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) ist die strahlungslose Übertragung von Energie von einem angeregten Donor auf ein Akzeptormolekül und hängt vom Abstand und der Ausrichtung der Moleküle sowie dem Ausmaß der Überlappung zwischen den Donoremissions- und Akzeptorabsorptionsspektren ab. FRET ermöglicht es, die Interaktion von Proteinen in der lebenden Zelle im Laufe der Zeit und in verschiedenen subzellulären Kompartimenten zu untersuchen. In der Literatur wurden verschiedene intensitätsbasierte Algorithmen zur Messung von FRET mittels Mikroskopie beschrieben. Hier werden ein Protokoll und ein Algorithmus zur Quantifizierung der FRET-Effizienz bereitgestellt, die sowohl auf der Messung der sensibilisierten Emission des Akzeptors als auch der Abschreckung des Donormoleküls basieren. Die Quantifizierung der ratiometrischen FRET in der lebenden Zelle erfordert nicht nur die Bestimmung des Übersprechens (spektraler Spillover oder Bleed-Through) der fluoreszierenden Proteine, sondern auch die Detektionseffizienz des mikroskopischen Aufbaus. Das hier bereitgestellte Protokoll beschreibt, wie diese kritischen Parameter zu bewerten sind.
Introduction
Die mikroskopische Analyse des Förster-Resonanz-Energietransfers (FRET) ermöglicht die Beurteilung der Wechselwirkungen zwischen Proteinen in lebenden Zellen. Es liefert räumliche und zeitliche Informationen, einschließlich Informationen darüber, wo in der Zelle und in welchem subzellulären Kompartiment die Interaktion stattfindet und ob sich diese Interaktion im Laufe der Zeit ändert.
Theodor Förster legte 1948 die theoretischen Grundlagen der FRET1. FRET ist eine strahlungslose Energieübertragung von einem angeregten Donor zu einem Akzeptormolekül und hängt vom Abstand der Moleküle und der relativen Orientierung ihrer Übergangsdipole sowie von der Überlappung zwischen den Donoremissions- und Akzeptorabsorptionsspektren ab. Die Energieübertragungsrate ist umgekehrt proportional zur sechsten Potenz des Donor-Akzeptor-Abstands. Somit kann FRET verwendet werden, um die molekulare Nähe im Bereich von 1-10 nm zu messen.
FRET konkurriert mit anderen De-Anregungsprozessen des Donormoleküls und führt zur sogenannten Donor-Quenching und sensibilisierten Emission des Akzeptors. Donor-Quenching ist eine Verringerung der Anzahl der emittierten Donorphotonen, während sensibilisierte Emission eine Erhöhung der emittierten Akzeptorphotonen ist. Viele mikroskopische FRET-Analysen verwenden Fluoreszenzintensitätsmessungen, einschließlich Akzeptor-Photobleiche 2, Donor-Photobleiche2 oder FRET-sensibilisiertes Photobleichen des Akzeptors3.
Hier werden ein Schritt-für-Schritt-Versuchsprotokoll und ein mathematischer Algorithmus zur Quantifizierung von FRET unter Verwendung von Donor Quenching und akzeptorsensibilisierter Emission4,5 vorgestellt, einer Methode, die oft als ratiometrische FRET bezeichnet wird. Es wurden viele Protokolle zur Annäherung an die sensibilisierte Emission veröffentlicht, nur wenige haben den absoluten FRET-Wirkungsgrad 6,7,8,9 quantifiziert. Die Quantifizierung der FRET-Effizienz in der lebenden Zelle erfordert die Bestimmung (i) des Übersprechens (spektraler Spillover oder Bleed-Through) der fluoreszierenden Proteine und (ii) der Detektionseffizienz des mikroskopischen Aufbaus. Während das Übersprechen durch die Bildgebung von Zellen beurteilt werden kann, die nur eines der Fluorophore exprimieren, ist die Beurteilung der relativen Detektionseffizienz der Donor- und Akzeptorfluoreszenz komplizierter. Es erfordert die Kenntnis mindestens des Verhältnisses der Anzahl der Donor- und Akzeptormoleküle, die zu den gemessenen Signalen führen. Die Anzahl der in lebenden Zellen exprimierten Fluorophore variiert jedoch von Zelle zu Zelle und ist unbekannt. Der sogenannte α-Faktor charakterisiert die relativen Signalstärken eines einzelnen angeregten Donor- und Akzeptormoleküls. Die Kenntnis des Faktors ist eine Voraussetzung für quantitative ratiometrische FRET-Messungen in Proben mit variablen Akzeptor-zu-Donor-Molekül-Verhältnissen, wie sie bei der Bildgebung lebender Zellen mit fluoreszierenden Proteinen auftreten. Die Verwendung eines 1-zu-1-Donor-Akzeptor-Fusionsproteins als Kalibriersonde ermöglicht die Bestimmung des α Faktors und dient gleichzeitig als Positivkontrolle. Diese genetisch gekoppelte Sonde wird von Zellen in unbekannten Gesamtmengen, aber in einer festen und bekannten relativen Menge von eins zu eins exprimiert. Das folgende Protokoll beschreibt, wie die 1-zu-1-Sonde aufgebaut und zur Quantifizierung der FRET-Effizienz verwendet wird. Eine Tabelle, die alle Formeln enthält, finden Sie in der Beilage und kann von den Lesern verwendet werden, um ihre eigenen Maße in die jeweiligen Spalten einzugeben, wie unten beschrieben.
Während das Protokoll das GFP-Cherry-Donor/Akzeptor-Paar verwendet, kann der vorgestellte Ansatz mit jedem anderen FRET-Paar durchgeführt werden. Die Zusatzdatei 1 enthält Details zu cyan-gelben Paaren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Verwendung der genetisch gekoppelten Eins-zu-Eins-Fluoreszenzprotein-Kalibrierungssonde zur Quantifizierung von FRET unter Verwendung des Nachweises der sensibilisierten Emission des Akzeptors und des Quenchings des Donormoleküls durch konfokale Mikroskopie. Diese Methode kann angewendet werden, um Proteininteraktionen im physiologischen Kontext der lebenden Zelle in verschiedenen subzellulären Kompartimenten zu bewerten. Die räumliche Auflösung kann weiter verbessert werden,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem Neuroscience Imaging Service der Stanford University School of Medicine für die Bereitstellung von Ausrüstung und Raum für dieses Projekt. Diese Forschung wurde durch intramurale Mittel des Stanford Cancer Institute und der Abteilung für gynäkologische Onkologie Stanford sowie durch GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 des Nationalen Büros für Forschung, Entwicklung und Innovation, Ungarn, unterstützt.
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Clontech mCherry N1 vector | Addgene | 3553 | |
| DMEM without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 |
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