Valutazione delle interazioni proteiche nelle cellule vive con emissione sensibilizzata alla FRET
Summary
Il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) tra due molecole di fluorofori può essere utilizzato per studiare le interazioni proteiche nella cellula vivente. Qui, viene fornito un protocollo su come misurare la FRET nelle cellule vive rilevando l’emissione sensibilizzata dell’accettore e la tempra della molecola donatrice utilizzando la microscopia a scansione laser confocale.
Abstract
Il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) è il trasferimento di energia senza radiazioni da un donatore eccitato a una molecola accettore e dipende dalla distanza e dall’orientamento delle molecole, nonché dall’entità della sovrapposizione tra gli spettri di emissione del donatore e di assorbimento dell’accettore. FRET permette di studiare l’interazione delle proteine nella cellula vivente nel tempo e in diversi compartimenti subcellulari. In letteratura sono stati descritti diversi algoritmi basati sull’intensità per misurare la FRET utilizzando la microscopia. Qui vengono forniti un protocollo e un algoritmo per quantificare l’efficienza FRET sulla base della misurazione sia dell’emissione sensibilizzata dell’accettore che della tempra della molecola donatrice. La quantificazione della FRET raziometrica nella cellula vivente richiede non solo la determinazione della diafonia (spill-over spettrale, o bleed-through) delle proteine fluorescenti, ma anche l’efficienza di rilevazione della configurazione microscopica. Il protocollo fornito qui descrive come valutare questi parametri critici.
Introduction
L’analisi basata sulla microscopia del trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) consente di valutare le interazioni tra proteine in cellule vive. Fornisce informazioni spaziali e temporali, comprese informazioni su dove nella cellula e in quale compartimento subcellulare avviene l’interazione e se questa interazione cambia nel tempo.
Theodor Förster pose le basi teoriche della FRET nel 19481. La FRET è un trasferimento di energia senza radiazioni da un donatore eccitato a una molecola accettore e dipende dalla distanza delle molecole e dall’orientamento relativo dei loro dipoli di transizione, nonché dalla sovrapposizione tra gli spettri di emissione del donatore e di assorbimento dell’accettore. La velocità di trasferimento di energia è inversamente proporzionale alla sesta potenza della distanza donatore-accettore. Pertanto, FRET può essere utilizzato per misurare la prossimità molecolare nell’intervallo 1-10 nm.
La FRET compete con altri processi di deeccitazione della molecola donatrice e provoca il cosiddetto donor-quenching e l’emissione sensibilizzata dell’accettore. L’estinzione del donatore è una riduzione del numero di fotoni donatori emessi, mentre l’emissione sensibilizzata è un aumento dei fotoni accettori emessi. Molte analisi microscopiche FRET utilizzano misure di intensità di fluorescenza, tra cui il fotosbiancamento dell’accettore 2, il fotosbiancamento del donatore2 o il fotosbiancamento dell’accettore3 sensibilizzato al FRET.
Qui, un protocollo sperimentale passo-passo e un algoritmo matematico sono presentati per quantificare FRET utilizzando la tempra del donatore e l’emissione sensibilizzata all’accettore4,5, un metodo spesso indicato come FRET raziometrico. Sono stati pubblicati molti protocolli su come approssimare l’emissione sensibilizzata, pochi hanno quantificato l’efficienza assoluta FRET 6,7,8,9. La quantificazione delle efficienze FRET nella cellula vivente richiede la determinazione (i) della diafonia (spill-over spettrale o sanguinamento) delle proteine fluorescenti e, inoltre, (ii) dell’efficienza di rilevazione della configurazione microscopica. Mentre la diafonia può essere valutata mediante imaging delle cellule che esprimono solo uno dei fluorofori, la valutazione dell’efficienza di rilevazione relativa della fluorescenza del donatore e dell’accettore è più complicata. Richiede la conoscenza almeno del rapporto tra il numero di molecole donatrici e accettori che danno origine ai segnali misurati. Il numero di fluorofori espressi nelle cellule vive varia, tuttavia, da cellula a cellula ed è sconosciuto. Il cosiddetto fattore α caratterizza le potenze del segnale relative da una singola molecola eccitata del donatore e dell’accettore. La conoscenza del fattore è un prerequisito per le misure quantitative raziometriche FRET in campioni con rapporti molecola accettore-donatore variabili come riscontrato durante l’imaging di cellule vive con proteine fluorescenti. L’utilizzo di una proteina di fusione donatore-accettore 1 a 1 come sonda di calibrazione consente la determinazione del fattore α e serve anche come controllo positivo. Questa sonda geneticamente accoppiata è espressa dalle cellule in quantità totali sconosciute ma in una quantità relativa fissa e nota di uno-a-uno. Il seguente protocollo spiega come costruire la sonda 1-to-1 e come utilizzarla per quantificare l’efficienza del FRET. Un foglio di calcolo che include tutte le formule può essere trovato nel supplemento e può essere utilizzato dai lettori per inserire le proprie misure nelle rispettive colonne come descritto di seguito.
Mentre il protocollo utilizza la coppia donatore/accettore GFP-Cherry, l’approccio presentato può essere eseguito con qualsiasi altra coppia FRET. Il file supplementare 1 fornisce dettagli sulle coppie ciano-giallo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo presentato descrive in dettaglio l’uso della sonda di calibrazione della proteina fluorescente uno-a-uno geneticamente accoppiata per quantificare la FRET utilizzando la rilevazione dell’emissione sensibilizzata dell’accettore e la tempra della molecola donatrice mediante microscopia confocale. Questo metodo può essere applicato per valutare le interazioni proteiche nel contesto fisiologico della cellula vivente in diversi compartimenti subcellulari. La risoluzione spaziale può essere ulteriormente miglio…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il Neuroscience Imaging Service della Stanford University School of Medicine per aver fornito attrezzature e spazio per questo progetto. Questa ricerca è stata supportata dal finanziamento intramurale dello Stanford Cancer Institute e della Gynecologic Oncology Division Stanford, nonché da GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 dal National Research, Development and Innovation Office, Ungheria.
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Clontech mCherry N1 vector | Addgene | 3553 | |
| DMEM without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 |
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