הערכת אינטראקציות חלבונים בתאים חיים עם פליטה רגישה ל-FRET
Summary
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) בין שתי מולקולות פלואורופור יכול לשמש לחקר אינטראקציות חלבונים בתא החי. כאן, פרוטוקול מסופק כיצד למדוד FRET בתאים חיים על ידי זיהוי פליטה רגישה של המקבל ומרווה של מולקולת התורם באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.
Abstract
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) היא העברת אנרגיה ללא קרינה מתורם נרגש למולקולה מקבלת ותלויה במרחק ובכיוון של המולקולות, כמו גם במידת החפיפה בין ספקטרום פליטת התורם לספקטרום קליטת המקבל. FRET מאפשר לחקור את האינטראקציה של חלבונים בתא החי לאורך זמן ובתאים תת-תאיים שונים. אלגוריתמים שונים מבוססי עוצמה למדידת FRET באמצעות מיקרוסקופיה תוארו בספרות. כאן, פרוטוקול ואלגוריתם מסופקים לכימות יעילות FRET בהתבסס על מדידת הפליטה הרגישה של המקבל ומרווה של מולקולת התורם. הכימות של FRET יחסימטרי בתא החי דורש לא רק את קביעת הקרוס-טוק (זליגה ספקטרלית, או דימום) של החלבונים הפלואורסצנטיים, אלא גם את יעילות הזיהוי של המערך המיקרוסקופי. הפרוטוקול המובא כאן מפרט כיצד להעריך פרמטרים קריטיים אלה.
Introduction
ניתוח מבוסס מיקרוסקופיה של Förster Resonance Energy Transfer (FRET) מאפשר הערכה של אינטראקציות בין חלבונים בתאים חיים. הוא מספק מידע מרחבי וזמני, כולל מידע על היכן בתא ובאיזה תא תת-תאי מתרחשת האינטראקציה ואם אינטראקציה זו משתנה עם הזמן.
תיאודור פורסטר הניח את הבסיס התאורטי של FRET בשנת 19481. FRET היא העברה ללא קרינה של אנרגיה מתורם נרגש למולקולת קבלה, והיא תלויה במרחק המולקולות ובאוריינטציה היחסית של דיפולי המעבר שלהן, כמו גם בחפיפה בין ספקטרום פליטת התורם לספקטרום קליטת המקבל. קצב העברת האנרגיה עומד ביחס הפוך לחזקה השישית של מרחק התורם-מקבל. לפיכך, FRET יכול לשמש למדידת קרבה מולקולרית בטווח של 1-10 ננומטר.
FRET מתחרה בתהליכי עירור אחרים של מולקולת התורם ומביא למה שמכונה פליטה מרוותה ורגישה של התורם של המקבל. מרווה מתורם היא הפחתה של מספר פוטוני התורם הנפלטים, בעוד פליטה רגישה היא עלייה בפוטונים הקולטים הנפלטים. ניתוחי FRET מיקרוסקופיים רבים משתמשים במדידות עוצמת פלואורסצנטיות, כולל הלבנה פוטואורסצנטית של המקבל 2, הלבנה פוטו-לוגית של תורם2, או הלבנה פוטו-רגישה ל-FRET של המקבל3.
כאן, פרוטוקול ניסויי שלב אחר שלב ואלגוריתם מתמטי מוצגים כדי לכמת FRET באמצעות מרווה תורם ומקבל פליטה רגישה4,5, שיטה המכונה לעתים קרובות FRET יחסי. פרוטוקולים רבים כיצד להעריך פליטה רגישה פורסמו, מעטים כימתו את יעילות FRET המוחלטת 6,7,8,9. כימות יעילות FRET בתא החי דורש לקבוע (i) את crosstalk (זליגה ספקטרלית, או דימום דרך) של החלבונים הפלואורסצנטיים, וגם (ii) את יעילות הזיהוי של המערך המיקרוסקופי. בעוד שניתן להעריך דיבור צולב על ידי תאי הדמיה המבטאים רק אחד מהפלואורופורים, הערכת יעילות הזיהוי היחסית של התורם והפלואורסצנטיות המקבלת מורכבת יותר. זה דורש ידע של לפחות את היחס בין מספר מולקולות תורם ומקבל היוצר את האותות הנמדדים. עם זאת, מספר הפלואורופורים המבוטאים בתאים חיים משתנה מתא לתא ואינו ידוע. מה שמכונה גורם α מאפיין את עוצמות האות היחסיות ממולקולת תורם ומקבל נרגשת אחת. ידיעת הגורם היא תנאי מוקדם למדידות FRET יחסיות כמותיות בדגימות עם יחסי מולקולות משתנים בין קבלה לתורם, כפי שנתקלים בהן במהלך הדמיה של תאים חיים עם חלבונים פלואורסצנטיים. שימוש בחלבון היתוך 1 ל-1 תורם-מקבל כבדיקת כיול מאפשר קביעת גורם α ומשמש גם כבקרה חיובית. בדיקה מצומדת גנטית זו מבוטאת על ידי תאים בכמויות כוללות לא ידועות אך בכמות יחסית קבועה וידועה של אחד לאחד. הפרוטוקול הבא מפרט כיצד לבנות את הגשושית 1 ל-1 וכיצד להשתמש בה לכימות יעילות FET. גיליון אלקטרוני הכולל את כל הנוסחאות נמצא במוסף ויכול לשמש את הקוראים כדי להזין את המידות שלהם בעמודות המתאימות כמפורט להלן.
בעוד שהפרוטוקול משתמש בזוג התורם/מקבל GFP-Cherry, ניתן לבצע את הגישה המוצגת עם כל זוג FRET אחר. הקובץ המשלים 1 מספק פרטים על זוגות ציאן-צהוב.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המוצג מפרט את השימוש בבדיקת כיול חלבון פלואורסצנטי מצומד גנטית אחד לאחד לכימות FRET באמצעות זיהוי פליטה רגישה של המקבל ומרווה של מולקולת התורם על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי. שיטה זו יכולה להיות מיושמת כדי להעריך אינטראקציות חלבונים בהקשר הפיזיולוגי של התא החי בתאים תת-תאיים שונים. נ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לשירות הדימות של מדעי המוח בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד על אספקת ציוד ומקום לפרויקט זה. מחקר זה נתמך על ידי מימון פנימי של מכון הסרטן של סטנפורד והחטיבה האונקולוגית הגינקולוגית בסטנפורד, כמו גם GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 מהמשרד הלאומי למחקר, פיתוח וחדשנות, הונגריה.
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Clontech mCherry N1 vector | Addgene | 3553 | |
| DMEM without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 |
References
- Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).
- Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
- Mekler, V. M. A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer. Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).
- Vamosi, G., et al. Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study. Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).
- Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).
- van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).
- Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).
- Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors. Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).
- Menaesse, A., et al. Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method. Cytometry Part A. , 24194 (2020).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173, 33-38 (1996).
- Nagy, P., et al. Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins. Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).
- Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein. Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).
- Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy. Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).
- Tron, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis. Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).
- Sebestyen, Z., et al. Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer. Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).
- Szaloki, N., et al. High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).
- McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity. Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).
- Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius. Biochimie. 45 (21), 6570-6580 (2006).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
- Scott, B. L., Hoppe, A. D. Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells. Science Reports. 5, 10270 (2015).
- Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it. Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).
- King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments. Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).
