评估具有FRET敏化发射的活细胞中的蛋白质相互作用
Summary
两个荧光团分子之间的福斯特共振能量转移（FRET）可用于研究活细胞中的蛋白质相互作用。在这里，提供了有关如何通过使用共聚焦激光扫描显微镜检测受体的敏化发射和供体分子的淬灭来测量活细胞中的FRET的协议。
Abstract
福斯特共振能量转移（FRET）是从激发的供体到受体分子的能量的无辐射转移，取决于分子的距离和方向以及供体发射和受体吸收光谱之间的重叠程度。FRET允许研究活细胞中蛋白质随时间变化和不同亚细胞区室中的相互作用。文献中已经描述了使用显微镜测量FRET的不同基于强度的算法。在这里，提供了一种协议和算法，用于基于测量受体的敏化发射和供体分子的淬灭来量化FRET效率。活细胞中比例FRET的定量不仅需要确定荧光蛋白的串扰（光谱溢出或渗漏），还需要确定显微镜装置的检测效率。此处提供的协议详细说明了如何评估这些关键参数。
Introduction
基于显微镜的福斯特共振能量转移（FRET）分析允许评估活细胞中蛋白质之间的相互作用。它提供空间和时间信息，包括有关细胞中发生相互作用的位置和亚细胞区室中发生以及这种相互作用是否随时间变化的信息。
Theodor Förster于1948年奠定了FRET的理论基础1.FRET是从激发的供体到受体分子的能量的无辐射转移，取决于分子的距离及其过渡偶极子的相对方向以及供体发射和受体吸收光谱之间的重叠。能量转移速率与供体-受体距离的六次方成反比。因此，FRET可用于测量1-10nm范围内的分子接近度。
FRET与供体分子的其他去激发过程竞争，并导致受体的所谓供体淬灭和敏化发射。供体猝灭是发射供体光子数量的减少，而敏化发射是发射受体光子的增加。许多显微FRET分析使用荧光强度测量，包括受体光漂白2，供体光漂白2或受体3的FRET敏化光漂白。
在这里，提出了一种分步实验方案和数学算法，以使用供体淬灭和受体敏化发射4，5（通常称为比率FRET）来量化FRET的方法。关于如何近似敏化发射的许多协议已经发布，很少有量化绝对FRET效率6，7，8，9。活细胞中FRET效率的定量需要确定（i）荧光蛋白的串扰（光谱溢出或渗漏），以及（ii）显微镜装置的检测效率。虽然串扰可以通过仅表达一种荧光团的细胞成像来评估，但对供体和受体荧光的相对检测效率的评估更为复杂。它至少需要了解产生测量信号的供体和受体分子数量的比率。然而，活细胞中表达的荧光团数量因细胞而异，并且是未知的。所谓的α因子表征来自单个激发供体和受体分子的相对信号强度。了解该因子是在具有可变受体-供体分子比例的样品中进行定量比例法FRET测量的先决条件，就像在使用荧光蛋白进行活细胞成像时遇到的一样。使用1对1供体-受体融合蛋白作为校准探针可以确定α因子，也可以作为阳性对照。这种基因偶联探针由细胞以未知的总量表达，但以固定且已知的相对量一对一表达。以下协议列出了如何构建1对1探头以及如何使用它来量化FRET效率。在增刊中可以找到包含所有公式的电子表格，读者可以使用该电子表格在相应的列中输入自己的测量值，如下所述。
虽然该协议使用GFP-Cherry供体/受体对，但所提出的方法可以用任何其他FRET对执行。 补充文件 1 提供了有关青黄色对的详细信息。
Protocol
Representative Results
Discussion
所提出的协议详细介绍了使用基因偶联的一对一荧光蛋白校准探针来量化FRET使用共聚焦显微镜检测受体的敏化发射和供体分子的淬灭。该方法可用于评估不同亚细胞区室中活细胞生理环境中的蛋白质相互作用。通过应用所提出的算法来计算图像每个像素的FRET效率（逐像素FRET），可以进一步提高空间分辨率。基于强度的绝对FRET效率测定需要确定串扰，此处用 S 因子量化，以及通过给定的显…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢斯坦福大学医学院的神经科学成像服务为这个项目提供设备和空间。这项研究得到了斯坦福癌症研究所和斯坦福妇科肿瘤科的校内资助，以及匈牙利国家研究、发展和创新办公室的GINOP-2.3.2-15-2016-00026、GINOP-2.3.3-15-2016-00030、NN129371、ANN135107。
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Clontech mCherry N1 vector | Addgene | 3553 | |
| DMEM without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 |
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