Evaluación de las interacciones de proteínas en células vivas con emisión sensibilizada por FRET
Summary
La transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) entre dos moléculas fluoróforas se puede utilizar para estudiar las interacciones de proteínas en la célula viva. Aquí, se proporciona un protocolo sobre cómo medir FRET en células vivas mediante la detección de la emisión sensibilizada del aceptor y el enfriamiento de la molécula donante utilizando microscopía de barrido láser confocal.
Abstract
La transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) es la transferencia de energía sin radiación de un donante excitado a una molécula aceptora y depende de la distancia y orientación de las moléculas, así como del grado de superposición entre los espectros de emisión donante y absorción aceptora. FRET permite estudiar la interacción de proteínas en la célula viva a lo largo del tiempo y en diferentes compartimentos subcelulares. En la literatura se han descrito diferentes algoritmos basados en la intensidad para medir FRET utilizando microscopía. Aquí, se proporciona un protocolo y un algoritmo para cuantificar la eficiencia FRET basada en la medición tanto de la emisión sensibilizada del aceptor como del enfriamiento de la molécula donante. La cuantificación de FRET ratiométrico en la célula viva no solo requiere la determinación de la diafonía (derrame espectral o sangrado) de las proteínas fluorescentes, sino también la eficiencia de detección de la configuración microscópica. El protocolo proporcionado aquí detalla cómo evaluar estos parámetros críticos.
Introduction
El análisis basado en microscopía de la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) permite evaluar las interacciones entre proteínas en células vivas. Proporciona información espacial y temporal, incluida información sobre dónde en la célula y en qué compartimento subcelular tiene lugar la interacción y si esta interacción cambia con el tiempo.
Theodor Förster sentó las bases teóricas de FRET en 19481. FRET es una transferencia de energía sin radiación de un donante excitado a una molécula aceptora y depende de la distancia de las moléculas y la orientación relativa de sus dipolos de transición, así como de la superposición entre los espectros de emisión donante y absorción aceptora. La tasa de transferencia de energía es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia donante-aceptante. Por lo tanto, FRET se puede utilizar para medir la proximidad molecular en el rango de 1-10 nm.
FRET compite con otros procesos de desexcitación de la molécula donante y da como resultado la llamada emisión sensibilizada y de enfriamiento del donante. La extinción del donante es una reducción del número de fotones donantes emitidos, mientras que la emisión sensibilizada es un aumento de los fotones aceptores emitidos. Muchos análisis FRET microscópicos utilizan mediciones de intensidad de fluorescencia, incluido el fotoblanqueo aceptor 2, el fotoblanqueo del donante2 o el fotoblanqueo sensibilizado por FRET del aceptor3.
Aquí, se presenta un protocolo experimental paso a paso y un algoritmo matemático para cuantificar FRET utilizando la extinción del donante y la emisión sensibilizada por aceptor4,5, un método a menudo denominado FRET ratiométrico. Se han publicado muchos protocolos sobre cómo aproximar la emisión sensibilizada, pocos han cuantificado la eficiencia FRET absoluta 6,7,8,9. La cuantificación de las eficiencias FRET en la célula viva requiere determinar (i) la diafonía (derrame espectral o sangrado) de las proteínas fluorescentes y, también (ii) la eficiencia de detección de la configuración microscópica. Mientras que la diafonía se puede evaluar mediante imágenes de células que expresan solo uno de los fluoróforos, la evaluación de la eficiencia de detección relativa de la fluorescencia donante y aceptora es más complicada. Requiere el conocimiento de al menos la relación entre el número de moléculas donadoras y aceptoras que dan lugar a las señales medidas. El número de fluoróforos expresados en células vivas varía, sin embargo, de célula a célula y es desconocido. El llamado factor α caracteriza las intensidades relativas de la señal de una sola molécula donante y aceptora excitada. El conocimiento del factor es un requisito previo para las mediciones cuantitativas ratiométricas de FRET en muestras con proporciones variables de moléculas aceptoras a donantes, como las que se encuentran durante las imágenes de células vivas con proteínas fluorescentes. El uso de una proteína de fusión donante-aceptor 1 a 1 como sonda de calibración permite la determinación del factor α y también sirve como control positivo. Esta sonda genéticamente acoplada es expresada por células en cantidades totales desconocidas, pero en una cantidad relativa fija y conocida de uno a uno. El siguiente protocolo establece cómo construir la sonda 1 a 1 y cómo usarla para cuantificar la eficiencia de FRET. Una hoja de cálculo que incluye todas las fórmulas se puede encontrar en el suplemento y puede ser utilizada por los lectores para ingresar sus propias medidas en las columnas respectivas como se describe a continuación.
Si bien el protocolo utiliza el par donante/aceptor GFP-Cherry, el enfoque presentado se puede realizar con cualquier otro par FRET. El Archivo Suplementario 1 proporciona detalles sobre los pares cian-amarillo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado detalla el uso de la sonda de calibración de proteínas fluorescentes uno a uno acoplada genéticamente para cuantificar FRET utilizando la detección de emisión sensibilizada del aceptor y enfriamiento de la molécula donante por microscopía confocal. Este método se puede aplicar para evaluar las interacciones de proteínas en el contexto fisiológico de la célula viva en diferentes compartimentos subcelulares. La resolución espacial se puede mejorar aún más aplicando el algoritmo present…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer al Servicio de Imágenes de Neurociencia de la Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford por proporcionar equipos y espacio para este proyecto. Esta investigación fue apoyada por fondos intramuros del Instituto de Cáncer de Stanford y la División de Oncología Ginecológica de Stanford, así como GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 de la Oficina Nacional de Investigación, Desarrollo e Innovación, Hungría.
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Clontech mCherry N1 vector | Addgene | 3553 | |
| DMEM without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 |
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