Bedömning av proteininteraktioner i levande celler med FRET-sensibiliserad emission
Summary
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) mellan två fluoroformolekyler kan användas för att studera proteininteraktioner i den levande cellen. Här tillhandahålls ett protokoll för hur man mäter FRET i levande celler genom att detektera sensibiliserad emission av acceptorn och släckning av donatormolekylen med hjälp av konfokal laserskanningsmikroskopi.
Abstract
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) är den strålningsfria överföringen av energi från en exciterad givare till en acceptormolekyl och beror på molekylernas avstånd och orientering samt graden av överlappning mellan givaremissionen och acceptorabsorptionsspektra. FRET tillåter att studera interaktionen mellan proteiner i den levande cellen över tid och i olika subcellulära fack. Olika intensitetsbaserade algoritmer för att mäta FRET med mikroskopi har beskrivits i litteraturen. Här tillhandahålls ett protokoll och en algoritm för att kvantifiera FRET-effektivitet baserat på mätning av både acceptorns sensibiliserade emission och kylning av donatormolekylen. Kvantifieringen av ratiometrisk FRET i den levande cellen kräver inte bara bestämning av överhörning (spektral spill-over eller genomblödning) av de fluorescerande proteinerna utan också detektionseffektiviteten hos den mikroskopiska inställningen. Protokollet som tillhandahålls här beskriver hur man bedömer dessa kritiska parametrar.
Introduction
Mikroskopibaserad analys av Förster Resonance Energy Transfer (FRET) möjliggör bedömning av interaktioner mellan proteiner i levande celler. Det ger rumslig och tidsmässig information, inklusive information om var i cellen och i vilket subcellulärt fack interaktionen äger rum och om denna interaktion förändras över tiden.
Theodor Förster lade den teoretiska grunden för FRET 19481. FRET är en strålningsfri överföring av energi från en exciterad givare till en acceptormolekyl och beror på molekylernas avstånd och den relativa orienteringen av deras övergångsdipoler samt överlappningen mellan givaremissionen och acceptorabsorptionsspektra. Energiöverföringshastigheten är omvänt proportionell mot den sjätte effekten av givar-acceptoravståndet. Således kan FRET användas för att mäta molekylär närhet i intervallet 1-10 nm.
FRET konkurrerar med andra de-excitationsprocesser av givarmolekylen och resulterar i den så kallade donatorsläckningen och sensibiliserade emissionen av acceptorn. Donatorsläckning är en minskning av antalet emitterade donatorfotoner, medan sensibiliserad emission är en ökning av emitterade acceptorfotoner. Många mikroskopiska FRET-analyser använder fluorescensintensitetsmätningar, inklusive acceptorfotoblekning 2, givarfotoblekning2 eller FRET-sensibiliserad fotoblekning av acceptorn3.
Här presenteras ett steg-för-steg-experimentellt protokoll och matematisk algoritm för att kvantifiera FRET med hjälp av donatorkylning och acceptorsensibiliserad emission4,5, en metod som ofta kallas ratiometrisk FRET. Många protokoll om hur man approximerar sensibiliserade utsläpp har publicerats, få har kvantifierat den absoluta FRET-effektiviteten 6,7,8,9. Kvantifieringen av FRET-effektiviteten i den levande cellen kräver bestämning av (i) överhörning (spektral spill-over eller genomblödning) av de fluorescerande proteinerna och även (ii) detektionseffektiviteten hos den mikroskopiska installationen. Medan överhörning kan bedömas genom att avbilda celler som endast uttrycker en av fluoroforerna, är bedömningen av den relativa detektionseffektiviteten hos givaren och acceptorfluorescensen mer komplicerad. Det kräver kunskap om åtminstone förhållandet mellan antalet donator- och acceptormolekyler som ger upphov till de uppmätta signalerna. Antalet fluoroforer som uttrycks i levande celler varierar dock från cell till cell och är okänt. Den så kallade α faktorn karakteriserar de relativa signalstyrkorna från en enda exciterad donator- och acceptormolekyl. Kunskap om faktorn är en förutsättning för kvantitativa ratiometriska FRET-mätningar i prover med variabla acceptor-till-donatormolekylförhållanden som påträffas vid avbildning av levande celler med fluorescerande proteiner. Användning av ett 1-till-1 donatoracceptorfusionsprotein som kalibreringssond möjliggör bestämning av den α faktorn och fungerar också som en positiv kontroll. Denna genetiskt kopplade sond uttrycks av celler i okända totala mängder men i en fast och känd relativ mängd en-till-en. Följande protokoll beskriver hur man konstruerar 1-till-1-sonden och hur man använder den för kvantifiering av FRET-effektivitet. Ett kalkylblad som innehåller alla formler finns i tillägget och kan användas av läsarna för att ange sina egna mått i respektive kolumn enligt beskrivningen nedan.
Medan protokollet använder GFP-Cherry-donator-/acceptorparet, kan det presenterade tillvägagångssättet utföras med vilket annat FRET-par som helst. Tilläggsfil 1 innehåller information om cyangula par.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det presenterade protokollet beskriver användningen av den genetiskt kopplade en-till-en fluorescerande proteinkalibreringssonden för kvantifiering av FRET med hjälp av detektion av sensibiliserad emission av acceptorn och släckning av givarmolekylen genom konfokalmikroskopi. Denna metod kan tillämpas för att bedöma proteininteraktioner i den levande cellens fysiologiska sammanhang i olika subcellulära fack. Den rumsliga upplösningen kan förbättras ytterligare genom att använda den presenterade algoritmen fö…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Neuroscience Imaging Service vid Stanford University School of Medicine för att tillhandahålla utrustning och utrymme för detta projekt. Denna forskning stöddes av intramural finansiering av Stanford Cancer Institute och Gynecologic Oncology Division Stanford samt GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 från National Research, Development and Innovation Office, Ungern.
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Clontech mCherry N1 vector | Addgene | 3553 | |
| DMEM without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 |
References
- Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).
- Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
- Mekler, V. M. A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer. Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).
- Vamosi, G., et al. Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study. Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).
- Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).
- van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).
- Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).
- Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors. Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).
- Menaesse, A., et al. Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method. Cytometry Part A. , 24194 (2020).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173, 33-38 (1996).
- Nagy, P., et al. Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins. Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).
- Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein. Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).
- Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy. Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).
- Tron, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis. Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).
- Sebestyen, Z., et al. Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer. Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).
- Szaloki, N., et al. High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).
- McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity. Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).
- Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius. Biochimie. 45 (21), 6570-6580 (2006).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
- Scott, B. L., Hoppe, A. D. Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells. Science Reports. 5, 10270 (2015).
- Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it. Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).
- King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments. Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).
