Modellazione delle metastasi cerebrali tramite iniezione di vena della coda di cellule infiammatorie del cancro al seno
Summary
Descriviamo un modello murino di xenotrapianto di metastasi cerebrali di cancro al seno generate tramite iniezione di vena della coda di una linea cellulare di carcinoma mammario infiammatorio amplificata endogenamente da HER2.
Abstract
La diffusione metastatica al cervello è una manifestazione comune e devastante di molti tipi di cancro. Solo negli Stati Uniti, circa 200.000 pazienti vengono diagnosticati con metastasi cerebrali ogni anno. Sono stati compiuti progressi significativi nel miglioramento dei risultati di sopravvivenza per le pazienti con carcinoma mammario primario e tumori maligni sistemici; Tuttavia, la prognosi infausta per i pazienti con metastasi cerebrali cliniche evidenzia l’urgente necessità di sviluppare nuovi agenti terapeutici e strategie contro questa malattia mortale. La mancanza di modelli sperimentali adeguati è stato uno dei principali ostacoli che hanno impedito il progresso della nostra comprensione della biologia e del trattamento delle metastasi cerebrali. Qui, descriviamo un modello murino di xenotrapianto di metastasi cerebrali generate tramite iniezione venosa della coda di una linea cellulare amplificata endogenamente da HER2 derivata dal carcinoma mammario infiammatorio (IBC), una forma rara e aggressiva di cancro al seno. Le cellule sono state marcate con luciferasi della lucciola e proteina di fluorescenza verde per monitorare le metastasi cerebrali e quantificato il carico metastatico mediante imaging a bioluminescenza, stereomicroscopia fluorescente e valutazione istologica. I topi sviluppano in modo robusto e coerente metastasi cerebrali, consentendo lo studio di mediatori chiave nel processo metastatico e lo sviluppo di test preclinici di nuove strategie di trattamento.
Introduction
Le metastasi cerebrali sono una complicanza comune e mortale dei tumori maligni sistemici. La maggior parte delle metastasi cerebrali provengono da tumori primari del polmone, della mammella o della pelle, che rappresentano collettivamente il 67-80% dei casi 1,2. Le stime dell’incidenza delle metastasi cerebrali variano tra 100.000 e 240.000 casi e questi numeri possono essere sottostimati perché l’autopsia è rara per i pazienti morti di cancro metastatico3. I pazienti con metastasi cerebrali hanno una prognosi peggiore e una sopravvivenza globale inferiore rispetto ai pazienti senza metastasi cerebrali4. Le attuali opzioni di trattamento per le metastasi cerebrali sono in gran parte palliative e non riescono a migliorare i risultati di sopravvivenza per la maggior parte dei pazienti5. Pertanto, le metastasi cerebrali rimangono una sfida e rimane urgente la necessità di comprendere meglio i meccanismi di progressione delle metastasi cerebrali per sviluppare terapie più efficaci.
L’utilizzo di modelli sperimentali ha fornito importanti approfondimenti sui meccanismi specifici della progressione metastatica del carcinoma mammario al cervello e ha permesso di valutare l’efficacia di vari approcci terapeutici 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . Tuttavia, pochissimi modelli possono ricapitolare in modo accurato e completo la complessità dello sviluppo delle metastasi cerebrali. Diversi modelli sperimentali in vivo sono stati generati tramite inoculazione di cellule tumorali nei topi da diverse vie di somministrazione, tra cui iniezioni ortotopiche, venose della coda, intracardiache, arteriose intracarotidi e intracerebrali. Ogni tecnica presenta vantaggi e svantaggi, come esaminato altrove3. Nessuno di questi modelli murini, tuttavia, può replicare completamente la progressione clinica delle metastasi cerebrali.
Le metastasi cerebrali sono particolarmente comuni nei pazienti con carcinoma mammario infiammatorio (IBC), una variante rara ma aggressiva del carcinoma mammario primario. IBC rappresenta dall’1% al 4% dei casi di cancro al seno, ma è responsabile di uno sproporzionato 10% dei decessi correlati al cancro al seno negli Stati Uniti17,18. IBC è noto per metastatizzare rapidamente; infatti, un terzo dei pazienti con IBC ha metastasi a distanza al momento della diagnosi19,20. Specifico per le metastasi cerebrali, i pazienti con IBC hanno una maggiore incidenza di metastasi cerebrali rispetto ai pazienti con non-IBC21. Recentemente, abbiamo dimostrato che la linea cellulare MDA-IBC3, derivata dal liquido di versamento pleurico maligno di un paziente con IBC ER-/PR–/HER2+ che ricapitola le caratteristiche IBC negli xenotrapianti di topo, ha una maggiore propensione a sviluppare metastasi cerebrali piuttosto che metastasi polmonari nei topi quando iniettati dalla vena della coda, rendendo questa linea cellulare un buon modello per studiare lo sviluppo delle metastasi cerebrali16.
Qui descriviamo le procedure per generare metastasi cerebrali tramite iniezione di vene della coda di cellule MDA-IBC3 e per valutare il carico metastatico tramite microscopia stereofluorescente e imaging della luciferasi. Questo metodo è stato utilizzato per scoprire mediatori chiave delle metastasi del cancro al seno al cervello e per testare l’efficacia degli interventi terapeutici 16,22,23. Lo svantaggio di questa tecnica è che non ricapitola tutti i passaggi nel processo metastatico cerebrale. Tuttavia, i suoi principali vantaggi includono robustezza e riproducibilità, coinvolgimento della biologia delle metastasi rilevanti dell’intravasazione, attraversamento dei polmoni e stravaso nel cervello e la sua relativa semplicità in termini di tecnica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo include diversi passaggi critici. Le cellule devono essere tenute sul ghiaccio per non più di 1 ora per mantenere la vitalità. I dischetti di cotone alcolico devono essere usati per pulire le code dei topi prima dell’iniezione, facendo attenzione a non pulire troppo forte o troppo spesso per evitare di danneggiare la pelle della coda. Assicurarsi che non siano presenti bolle d’aria nella sospensione cellulare, per evitare che i topi muoiano a causa degli emboli dei vasi sanguigni. Mantenere l’angolo di in…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Christine F. Wogan, MS, ELS, della Divisione di Radioterapia Oncologica di MD Anderson per la revisione scientifica del manoscritto, e Carol M. Johnston della Divisione di Chirurgia Istologia Core di MD Anderson per l’aiuto con la colorazione dell’ematossilina e dell’eosina. Siamo grati al Veterinary Medicine and Surgery Core di MD Anderson per il loro sostegno agli studi sugli animali. Questo lavoro è stato supportato dalle seguenti sovvenzioni: Susan G. Komen Career Catalyst Research grant (da CCR16377813 a BGD), American Cancer Society Research Scholar grant (RSG-19-126-01 a BGD) e State of Texas Rare and Aggressive Breast Cancer Research Program. Supportato anche in parte dal Cancer Center Support (Core) Grant P30 CA016672 dal National Cancer Institute, National Institutes of Health, all’MD Anderson Cancer Center dell’Università del Texas.
Materials
| Cell Culture | |||
| 1000 µL pipette tip filtered | Genesee Scientific | 23430 | |
| 10 mL Serological Pipets | Genesee Scientific | 12-112 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 1% |
| Centrifuge tubes 15 mL bulk | Genesee Scientific | 28103 | |
| Corning 500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine | GIBICO Inc. USA | MT10080CV | |
| Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Eppendorf centufuge 5810R | Eppendorf | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBICO Inc. USA | 16000044 | 10% |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers (40 μm) | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1 µg/mL |
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | 5 µg/mL |
| Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| MDA-IBC3 cell lines | MD Anderson Cancer Center | Generated by Dr. Woodward's lab24 | |
| Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid | System Biosciences | BLIV713PA-1 | |
| microtubes clear sterile 1.7 mL | Genesee Scientific | 24282S | |
| Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 23-401C | |
| TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Tail vein injection | |||
| C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J – SCID/Beige | Envigo | SCID/beige mice | |
| BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm) | BD | 328466 | |
| Plas Labs Broome-Style Rodent Restrainers | Plas Labs 551BSRR | 01-288-32A | Order fromThermo Fisher Scientific |
| Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof) | Thermo Fisher Scientific | 50420872 | 70 % used |
| Imaging | |||
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| Disposable PES Filter Units 0.45 µm | Fisherbrand | FB12566501 | filter system to sterilize the D-luciferin |
| D-Luciferin | Biosynth | L8220-1g | stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL |
| 1.7 mL microtube amber | Genesee Scientific | 24-282AM | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC-14043-704-06 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| IVIS 200 | PerkinElmer | machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine | |
| Plastic Containers with Lids | Fisherbrand | 02-544-127 | |
| Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 1000957 | |
| Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
| Stereomicroscope Imaging | |||
| Stereomicroscope AZ100 | Nikon | model AZ-STGE | software NIS-ELEMENT |
| Formalin 10% | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| TC treated dishes 100×20 mm | Genesee Scientific | 25202 |
References
- Achrol, A. S., et al. Brain metastases. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 5 (2019).
- Nayak, L., Lee, E. Q., Wen, P. Y. Epidemiology of brain metastases. Current Oncology Report. 14 (1), 48-54 (2012).
- Lowery, F. J., Yu, D. Brain metastasis: Unique challenges and open opportunities. Biochimica et Biophysica Acta Review Cancer. 1867 (1), 49-57 (2017).
- Brufsky, A. M., et al. Central nervous system metastases in patients with HER2-positive metastatic breast cancer: incidence, treatment, and survival in patients from registHER. Clinical Cancer Research. 17 (14), 4834-4843 (2011).
- Valiente, M., et al. The evolving landscape of brain metastasis. Trends in Cancer. 4 (3), 176-196 (2018).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Woditschka, S., et al. DNA double-strand break repair genes and oxidative damage in brain metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (7), (2014).
- Palmieri, D., et al. Vorinostat inhibits brain metastatic colonization in a model of triple-negative breast cancer and induces DNA double-strand breaks. Clinical Cancer Research. 15 (19), 6148-6157 (2009).
- Kim, S. J., et al. Astrocytes upregulate survival genes in tumor cells and induce protection from chemotherapy. Neoplasia. 13 (3), 286-298 (2011).
- Zhang, S., et al. SRC family kinases as novel therapeutic targets to treat breast cancer brain metastases. Recherche en cancérologie. 73 (18), 5764-5774 (2013).
- Valiente, M., et al. Serpins promote cancer cell survival and vascular co-option in brain metastasis. Cell. 156 (5), 1002-1016 (2014).
- Gril, B., et al. Effect of lapatinib on the outgrowth of metastatic breast cancer cells to the brain. Journal of the National Cancer Institute. 100 (15), 1092-1103 (2008).
- Gril, B., et al. Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis. Clinical Cancer Research. 17 (1), 142-153 (2011).
- Palmieri, D., et al. Profound prevention of experimental brain metastases of breast cancer by temozolomide in an MGMT-dependent manner. Clinical Cancer Research. 20 (10), 2727-2739 (2014).
- Priego, N., et al. STAT3 labels a subpopulation of reactive astrocytes required for brain metastasis. Nature Medicine. 24 (7), 1024-1035 (2018).
- Debeb, B. G., et al. miR-141-mediated regulation of brain metastasis from breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 108 (8), (2016).
- Chang, S., Parker, S. L., Pham, T., Buzdar, A. U., Hursting, S. D. Inflammatory breast carcinoma incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results program of the National Cancer Institute, 1975-1992. Cancer. 82 (12), 2366-2372 (1998).
- Hance, K. W., Anderson, W. F., Devesa, S. S., Young, H. A., Levine, P. H. Trends in inflammatory breast carcinoma incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results program at the National Cancer Institute. Journal of National Cancer Institute. 97 (13), 966-975 (2005).
- Dirix, L. Y., Van Dam, P., Prove, A., Vermeulen, P. B. Inflammatory breast cancer: Current understanding. Current Opinion in Oncology. 18 (6), 563-571 (2006).
- Wang, Z., et al. Pattern of distant metastases in inflammatory breast cancer – A large-cohort retrospective study. Journal of Cancer. 11 (2), 292-300 (2020).
- Uemura, M. I., et al. Development of CNS metastases and survival in patients with inflammatory breast cancer. Cancer. 124 (11), 2299-2305 (2018).
- Smith, D. L., Debeb, B. G., Thames, H. D., Woodward, W. A. Computational modeling of micrometastatic breast cancer radiation dose response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 96 (1), 179-187 (2016).
- Fukumura, K., et al. Multi-omic molecular profiling reveals potentially targetable abnormalities shared across multiple histologies of brain metastasis. Acta Neuropathol. , (2021).
- Klopp, A. H., et al. Mesenchymal stem cells promote mammosphere formation and decrease E-cadherin in normal and malignant breast cells. PLoS One. 5 (8), 12180 (2010).
- Villodre, E. S., et al. Abstract P3-01-10: Ndrg1-egfr axis in inflammatory breast cancer tumorigenesis and brain metastasis. Recherche en cancérologie. 80 (4), 10 (2020).
