Modelado de metástasis cerebral mediante inyección en la vena de cola de células inflamatorias de cáncer de mama
Summary
Describimos un modelo de xenoinjerto de ratón de metástasis cerebral de cáncer de mama generado mediante inyección en la vena de cola de una línea celular de cáncer de mama inflamatorio amplificada endógenamente por HER2.
Abstract
La diseminación metastásica al cerebro es una manifestación común y devastadora de muchos tipos de cáncer. Solo en los Estados Unidos, alrededor de 200,000 pacientes son diagnosticados con metástasis cerebrales cada año. Se han logrado avances significativos en la mejora de los resultados de supervivencia de las pacientes con cáncer de mama primario y neoplasias malignas sistémicas; Sin embargo, el sombrío pronóstico de los pacientes con metástasis cerebrales clínicas pone de manifiesto la necesidad urgente de desarrollar nuevos agentes terapéuticos y estrategias contra esta enfermedad mortal. La falta de modelos experimentales adecuados ha sido uno de los principales obstáculos que han impedido avanzar en nuestra comprensión de la biología y el tratamiento de las metástasis cerebrales. En este trabajo describimos un modelo de xenoinjerto de metástasis cerebral generada mediante inyección en la vena de cola de una línea celular amplificada endógenamente por HER2 derivada del cáncer de mama inflamatorio (IBC), una forma rara y agresiva de cáncer de mama. Las células se marcaron con luciferasa de luciérnaga y proteína de fluorescencia verde para monitorear la metástasis cerebral, y se cuantificó la carga metastásica mediante imágenes de bioluminiscencia, microscopía estereoscópica fluorescente y evaluación histológica. Los ratones desarrollan metástasis cerebrales de forma robusta y consistente, lo que permite la investigación de mediadores clave en el proceso metastásico y el desarrollo de pruebas preclínicas de nuevas estrategias de tratamiento.
Introduction
La metástasis cerebral es una complicación común y mortal de las neoplasias malignas sistémicas. La mayoría de las metástasis cerebrales se originan en tumores primarios de pulmón, mama o piel, que en conjunto representan el 67-80% de los casos 1,2. Las estimaciones de la incidencia de metástasis cerebrales varían entre 100.000 y 240.000 casos, y estas cifras pueden estar subestimadas porque la autopsia es poco frecuente en pacientes que murieron de cáncer metastásico3. Los pacientes con metástasis cerebrales tienen un peor pronóstico y una menor supervivencia global en relación con los pacientes sin metástasis cerebrales4. Las opciones de tratamiento actuales para las metástasis cerebrales son en gran medida paliativas y no mejoran los resultados de supervivencia de la mayoría de los pacientes5. Por lo tanto, la metástasis cerebral sigue siendo un desafío, y la necesidad sigue siendo apremiante de comprender mejor los mecanismos de progresión de la metástasis cerebral para desarrollar terapias más efectivas.
El uso de modelos experimentales ha proporcionado información importante sobre los mecanismos específicos de la progresión metastásica del cáncer de mama al cerebro y ha permitido evaluar la eficacia de diversos enfoques terapéuticos 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . Sin embargo, muy pocos modelos pueden recapitular de manera precisa y completa las complejidades del desarrollo de metástasis cerebrales. Se han generado varios modelos experimentales in vivo mediante la inoculación de células cancerosas en ratones mediante diferentes vías de administración, incluidas las inyecciones ortotópicas, de vena de cola, intracardíacas, intracarotídeas, arteriales intracarótidas e intracerebrales. Cada técnica tiene ventajas y desventajas, como se revisó en otro lugar3. Sin embargo, ninguno de estos modelos de ratón puede replicar completamente la progresión clínica de la metástasis cerebral.
Las metástasis cerebrales son particularmente comunes en pacientes con cáncer de mama inflamatorio (IBC, por sus siglas en inglés), una variante rara pero agresiva del cáncer de mama primario. El IBC representa entre el 1% y el 4% de los casos de cáncer de mama, pero es responsable de un desproporcionado 10% de las muertes relacionadas con el cáncer de mama en los Estados Unidos17,18. Se sabe que el IBC hace metástasis rápidamente; de hecho, un tercio de los pacientes con IBC tienen metástasis a distancia en el momento del diagnóstico19,20. Específicamente para la metástasis cerebral, los pacientes con IBC tienen una mayor incidencia de metástasis cerebral que los pacientes con IBCno 21. Recientemente, demostramos que la línea celular MDA-IBC3, derivada del líquido de derrame pleural maligno de un paciente con IBC ER-/PR–/HER2+ que recapitula las características de IBC en xenoinjertos de ratón, tiene una mayor propensión a desarrollar metástasis cerebrales en lugar de metástasis pulmonares en ratones cuando se inyecta por vena de cola, lo que convierte a esta línea celular en un buen modelo para estudiar el desarrollo de metástasis cerebrales16.
En este trabajo describimos los procedimientos para generar metástasis cerebrales mediante inyección en la vena de cola de células MDA-IBC3 y para evaluar la carga metastásica mediante microscopía estereofluorescente e imágenes de luciferasa. Este método se ha utilizado para descubrir mediadores clave de la metástasis del cáncer de mama en el cerebro y para probar la eficacia de las intervenciones terapéuticas 16,22,23. La desventaja de esta técnica es que no recapitula todos los pasos del proceso metastásico cerebral. Sin embargo, sus principales ventajas incluyen la robustez y reproducibilidad, la implicación de la biología de metástasis relevante de la intravasación, el atravesamiento de los pulmones y la extravasación en el cerebro, y su relativa simplicidad en términos de técnica.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo incluye varios pasos críticos. Las células deben mantenerse en hielo durante no más de 1 hora para mantener la viabilidad. Se deben usar almohadillas de algodón con alcohol para limpiar las colas de los ratones antes de la inyección, teniendo cuidado de no limpiar con demasiada fuerza o con demasiada frecuencia para evitar dañar la piel de la cola. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la suspensión celular, para evitar que los ratones mueran por émbolos en los vasos sanguíneos. Mantenga el …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Christine F. Wogan, MS, ELS, de la División de Oncología Radioterápica del MD Anderson por la edición científica del manuscrito, y a Carol M. Johnston, del Núcleo de Histología de la División de Cirugía del MD Anderson, por su ayuda con la tinción de hematoxilina y eosina. Agradecemos al Núcleo de Medicina y Cirugía Veterinaria del MD Anderson por su apoyo a los estudios con animales. Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones: Beca de Investigación Susan G. Komen Career Catalyst (CCR16377813 a BGD), Beca de Investigación de la Sociedad Americana Contra El Cáncer (RSG-19-126-01 a BGD) y el Programa de Investigación de Cáncer de Mama Raro y Agresivo del Estado de Texas. También cuenta con el apoyo parcial de la Subvención P30 de Apoyo al Centro Oncológico (Core) CA016672 del Instituto Nacional del Cáncer, de los Institutos Nacionales de la Salud, al Centro Oncológico MD Anderson de la Universidad de Texas.
Materials
| Cell Culture | |||
| 1000 µL pipette tip filtered | Genesee Scientific | 23430 | |
| 10 mL Serological Pipets | Genesee Scientific | 12-112 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 1% |
| Centrifuge tubes 15 mL bulk | Genesee Scientific | 28103 | |
| Corning 500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine | GIBICO Inc. USA | MT10080CV | |
| Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Eppendorf centufuge 5810R | Eppendorf | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBICO Inc. USA | 16000044 | 10% |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers (40 μm) | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1 µg/mL |
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | 5 µg/mL |
| Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| MDA-IBC3 cell lines | MD Anderson Cancer Center | Generated by Dr. Woodward's lab24 | |
| Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid | System Biosciences | BLIV713PA-1 | |
| microtubes clear sterile 1.7 mL | Genesee Scientific | 24282S | |
| Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 23-401C | |
| TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Tail vein injection | |||
| C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J – SCID/Beige | Envigo | SCID/beige mice | |
| BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm) | BD | 328466 | |
| Plas Labs Broome-Style Rodent Restrainers | Plas Labs 551BSRR | 01-288-32A | Order fromThermo Fisher Scientific |
| Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof) | Thermo Fisher Scientific | 50420872 | 70 % used |
| Imaging | |||
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| Disposable PES Filter Units 0.45 µm | Fisherbrand | FB12566501 | filter system to sterilize the D-luciferin |
| D-Luciferin | Biosynth | L8220-1g | stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL |
| 1.7 mL microtube amber | Genesee Scientific | 24-282AM | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC-14043-704-06 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| IVIS 200 | PerkinElmer | machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine | |
| Plastic Containers with Lids | Fisherbrand | 02-544-127 | |
| Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 1000957 | |
| Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
| Stereomicroscope Imaging | |||
| Stereomicroscope AZ100 | Nikon | model AZ-STGE | software NIS-ELEMENT |
| Formalin 10% | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| TC treated dishes 100×20 mm | Genesee Scientific | 25202 |
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