İnflamatuar Meme Kanseri Hücrelerinin Kuyruk-Ven Enjeksiyonu ile Beyin Metastazının Modellenmesi
Summary
Endojen olarak HER2 ile amplifiye edilmiş inflamatuar meme kanseri hücre hattının kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla üretilen meme kanseri beyin metastazının bir ksenogreft fare modelini tanımladık.
Abstract
Beyne metastatik yayılım, birçok kanser türünün yaygın ve yıkıcı bir tezahürüdür. Sadece Amerika Birleşik Devletleri’nde her yıl yaklaşık 200.000 hastaya beyin metastazı teşhisi konmaktadır. Primer meme kanseri ve sistemik maligniteleri olan hastalar için sağkalım sonuçlarının iyileştirilmesinde önemli ilerleme kaydedilmiştir; Bununla birlikte, klinik beyin metastazı olan hastalar için kasvetli prognoz, bu ölümcül hastalığa karşı yeni terapötik ajanlar ve stratejiler geliştirmeye acil ihtiyaç olduğunu vurgulamaktadır. Uygun deneysel modellerin olmaması, beyin metastazı biyolojisi ve tedavisi konusundaki anlayışımızın ilerlemesini engelleyen en büyük engellerden biri olmuştur. Burada, nadir ve agresif bir meme kanseri formu olan inflamatuar meme kanserinden (IBC) türetilen endojen olarak HER2 ile amplifiye edilmiş bir hücre hattının kuyruk veni enjeksiyonu yoluyla üretilen bir ksenogreft fare beyin metastazı modelini açıklıyoruz. Hücreler, beyin metastazını izlemek için ateşböceği lusiferaz ve yeşil floresan proteini ile etiketlendi ve biyolüminesans görüntüleme, floresan stereomikroskopi ve histolojik değerlendirme ile metastatik yükü ölçtü. Fareler sağlam ve tutarlı bir şekilde beyin metastazları geliştirir, bu da metastatik süreçteki anahtar aracıların araştırılmasına ve yeni tedavi stratejilerinin klinik öncesi testlerinin geliştirilmesine olanak tanır.
Introduction
Beyin metastazı, sistemik malignitelerin sık görülen ve ölümcül bir komplikasyonudur. Beyin metastazlarının çoğu, toplu olarak vakaların% 67-80’ini oluşturan akciğer, meme veya cildin primer tümörlerinden kaynaklanır 1,2. Beyin metastazı insidansı tahminleri 100.000 ila 240.000 vaka arasında değişmektedir ve bu sayılar metastatik kanserden ölen hastalar için otopsi nadir olduğu için hafife alınabilir3. Beyin metastazı olan hastalar, beyin metastazı olmayan hastalara göre daha kötü prognoza ve daha düşük genel sağkalıma sahiptir4. Beyin metastazları için mevcut tedavi seçenekleri büyük ölçüde palyatiftir ve çoğu hasta için sağkalım sonuçlarını iyileştirmede başarısızolur 5. Bu nedenle, beyin metastazı bir zorluk olmaya devam etmektedir ve daha etkili tedaviler geliştirmek için beyin metastazı ilerleme mekanizmalarını daha iyi anlama ihtiyacı devam etmektedir.
Deneysel modellerin kullanımı, meme kanserinin beyne metastatik ilerlemesinin spesifik mekanizmaları hakkında önemli bilgiler sağlamış ve çeşitli terapötik yaklaşımların etkinliğinin değerlendirilmesine izin vermiştir 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . Bununla birlikte, çok az sayıda model beyin metastazı gelişiminin inceliklerini doğru ve tam olarak özetleyebilir. Ortotopik, kuyruk damarı, intrakardiyak, intrakarotis arteriyel ve intraserebral enjeksiyonlar dahil olmak üzere farklı uygulama yollarıyla kanser hücrelerinin farelere aşılanması yoluyla birkaç deneysel in vivo model oluşturulmuştur. Her tekniğin avantajları ve dezavantajları vardır, başka bir yerde gözden geçirildiği gibi3. Bununla birlikte, bu fare modellerinin hiçbiri beyin metastazının klinik ilerlemesini tam olarak kopyalayamaz.
Beyin metastazları, primer meme kanserinin nadir fakat agresif bir varyantı olan inflamatuar meme kanseri (IBC) hastalarında özellikle yaygındır. IBC, meme kanseri vakalarının %1 ila %4’ünü oluşturur, ancak Amerika Birleşik Devletleri’nde meme kanserine bağlı ölümlerin orantısız bir şekilde %10’undan sorumludur17,18. IBC’nin hızla metastaz yaptığı bilinmektedir; Gerçekten de, IBC hastalarının üçte birinde tanı anında uzak metastaz vardır19,20. Beyin metastazı spesifik olarak, IBC’li hastalarda beyin metastazı insidansı, IBC olmayan hastalara göre daha yüksektir21. Son zamanlarda, fare ksenogreftlerinde IBC özelliklerini özetleyen ER-/PR-/HER2+ IBC’li bir hastanın malign plevral efüzyon sıvısından türetilen MDA-IBC3 hücre hattının, kuyruk damarı ile enjekte edildiğinde farelerde akciğer metastazlarından ziyade beyin metastazı geliştirme eğiliminin arttığını gösterdik, bu da bu hücre hattını beyin metastazının gelişimini incelemek için iyi bir model haline getirdi16.
Burada, MDA-IBC3 hücrelerinin kuyruk-ven enjeksiyonu ile beyin metastazı oluşturma ve stereofloresan mikroskopi ve lusiferaz görüntüleme ile metastatik yükü değerlendirme prosedürleri açıklanmaktadır. Bu yöntem, meme kanseri metastazının beyne anahtar aracılarını keşfetmek ve terapötik müdahalelerin etkinliğini test etmek için kullanılmıştır 16,22,23. Bu tekniğin dezavantajı, beyin metastatik sürecindeki tüm adımları özetlememesidir. Bununla birlikte, başlıca avantajları arasında sağlamlık ve tekrarlanabilirlik, intravazasyonun ilgili metastaz biyolojisinin katılımı, akciğerleri geçme ve beyne ekstravazasyon ve teknik açıdan göreceli basitliği sayılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol birkaç kritik adım içerir. Canlılığı korumak için hücreler 1 saatten fazla buz üzerinde tutulmamalıdır. Enjeksiyondan önce farelerin kuyruklarını silmek için alkollü pamuklu pedler kullanılmalı, kuyruk derisine zarar vermemek için çok sert veya çok sık silmemeye özen gösterilmelidir. Farelerin kan damarı embolisinden ölmesini önlemek için hücre süspansiyonunda hava kabarcığı bulunmadığından emin olun. Kuyruklardaki kan damarının delinmesini önlemek için enjeksiyon açıs?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Makalenin bilimsel düzenlemesi için MD Anderson’ın Radyasyon Onkolojisi Bölümü’nden Christine F. Wogan’a ve hematoksilen ve eozin boyama konusunda yardım için MD Anderson’ın Cerrahi Histoloji Çekirdeği Bölümü’nden Carol M. Johnston’a teşekkür ederiz. MD Anderson’daki Veterinerlik ve Cerrahi Merkezine hayvan çalışmalarına verdikleri destek için müteşekkiriz. Bu çalışma aşağıdaki hibelerle desteklenmiştir: Susan G. Komen Kariyer Katalizörü Araştırma hibesi (BGD’ye CCR16377813), Amerikan Kanser Derneği Araştırma Bursu hibesi (RSG-19-126-01’den BGD’ye) ve Teksas Eyaleti Nadir ve Agresif Meme Kanseri Araştırma Programı. Ayrıca, Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri’nden Teksas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi’ne CA016672 Kanser Merkezi Destek (Çekirdek) Hibe P30 tarafından kısmen desteklenmektedir.
Materials
| Cell Culture | |||
| 1000 µL pipette tip filtered | Genesee Scientific | 23430 | |
| 10 mL Serological Pipets | Genesee Scientific | 12-112 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 1% |
| Centrifuge tubes 15 mL bulk | Genesee Scientific | 28103 | |
| Corning 500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine | GIBICO Inc. USA | MT10080CV | |
| Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Eppendorf centufuge 5810R | Eppendorf | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBICO Inc. USA | 16000044 | 10% |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers (40 μm) | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1 µg/mL |
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | 5 µg/mL |
| Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| MDA-IBC3 cell lines | MD Anderson Cancer Center | Generated by Dr. Woodward's lab24 | |
| Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid | System Biosciences | BLIV713PA-1 | |
| microtubes clear sterile 1.7 mL | Genesee Scientific | 24282S | |
| Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 23-401C | |
| TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Tail vein injection | |||
| C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J – SCID/Beige | Envigo | SCID/beige mice | |
| BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm) | BD | 328466 | |
| Plas Labs Broome-Style Rodent Restrainers | Plas Labs 551BSRR | 01-288-32A | Order fromThermo Fisher Scientific |
| Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof) | Thermo Fisher Scientific | 50420872 | 70 % used |
| Imaging | |||
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| Disposable PES Filter Units 0.45 µm | Fisherbrand | FB12566501 | filter system to sterilize the D-luciferin |
| D-Luciferin | Biosynth | L8220-1g | stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL |
| 1.7 mL microtube amber | Genesee Scientific | 24-282AM | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC-14043-704-06 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| IVIS 200 | PerkinElmer | machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine | |
| Plastic Containers with Lids | Fisherbrand | 02-544-127 | |
| Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 1000957 | |
| Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
| Stereomicroscope Imaging | |||
| Stereomicroscope AZ100 | Nikon | model AZ-STGE | software NIS-ELEMENT |
| Formalin 10% | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| TC treated dishes 100×20 mm | Genesee Scientific | 25202 |
References
- Achrol, A. S., et al. Brain metastases. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 5 (2019).
- Nayak, L., Lee, E. Q., Wen, P. Y. Epidemiology of brain metastases. Current Oncology Report. 14 (1), 48-54 (2012).
- Lowery, F. J., Yu, D. Brain metastasis: Unique challenges and open opportunities. Biochimica et Biophysica Acta Review Cancer. 1867 (1), 49-57 (2017).
- Brufsky, A. M., et al. Central nervous system metastases in patients with HER2-positive metastatic breast cancer: incidence, treatment, and survival in patients from registHER. Clinical Cancer Research. 17 (14), 4834-4843 (2011).
- Valiente, M., et al. The evolving landscape of brain metastasis. Trends in Cancer. 4 (3), 176-196 (2018).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Woditschka, S., et al. DNA double-strand break repair genes and oxidative damage in brain metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (7), (2014).
- Palmieri, D., et al. Vorinostat inhibits brain metastatic colonization in a model of triple-negative breast cancer and induces DNA double-strand breaks. Clinical Cancer Research. 15 (19), 6148-6157 (2009).
- Kim, S. J., et al. Astrocytes upregulate survival genes in tumor cells and induce protection from chemotherapy. Neoplasia. 13 (3), 286-298 (2011).
- Zhang, S., et al. SRC family kinases as novel therapeutic targets to treat breast cancer brain metastases. Recherche en cancérologie. 73 (18), 5764-5774 (2013).
- Valiente, M., et al. Serpins promote cancer cell survival and vascular co-option in brain metastasis. Cell. 156 (5), 1002-1016 (2014).
- Gril, B., et al. Effect of lapatinib on the outgrowth of metastatic breast cancer cells to the brain. Journal of the National Cancer Institute. 100 (15), 1092-1103 (2008).
- Gril, B., et al. Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis. Clinical Cancer Research. 17 (1), 142-153 (2011).
- Palmieri, D., et al. Profound prevention of experimental brain metastases of breast cancer by temozolomide in an MGMT-dependent manner. Clinical Cancer Research. 20 (10), 2727-2739 (2014).
- Priego, N., et al. STAT3 labels a subpopulation of reactive astrocytes required for brain metastasis. Nature Medicine. 24 (7), 1024-1035 (2018).
- Debeb, B. G., et al. miR-141-mediated regulation of brain metastasis from breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 108 (8), (2016).
- Chang, S., Parker, S. L., Pham, T., Buzdar, A. U., Hursting, S. D. Inflammatory breast carcinoma incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results program of the National Cancer Institute, 1975-1992. Cancer. 82 (12), 2366-2372 (1998).
- Hance, K. W., Anderson, W. F., Devesa, S. S., Young, H. A., Levine, P. H. Trends in inflammatory breast carcinoma incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results program at the National Cancer Institute. Journal of National Cancer Institute. 97 (13), 966-975 (2005).
- Dirix, L. Y., Van Dam, P., Prove, A., Vermeulen, P. B. Inflammatory breast cancer: Current understanding. Current Opinion in Oncology. 18 (6), 563-571 (2006).
- Wang, Z., et al. Pattern of distant metastases in inflammatory breast cancer – A large-cohort retrospective study. Journal of Cancer. 11 (2), 292-300 (2020).
- Uemura, M. I., et al. Development of CNS metastases and survival in patients with inflammatory breast cancer. Cancer. 124 (11), 2299-2305 (2018).
- Smith, D. L., Debeb, B. G., Thames, H. D., Woodward, W. A. Computational modeling of micrometastatic breast cancer radiation dose response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 96 (1), 179-187 (2016).
- Fukumura, K., et al. Multi-omic molecular profiling reveals potentially targetable abnormalities shared across multiple histologies of brain metastasis. Acta Neuropathol. , (2021).
- Klopp, A. H., et al. Mesenchymal stem cells promote mammosphere formation and decrease E-cadherin in normal and malignant breast cells. PLoS One. 5 (8), 12180 (2010).
- Villodre, E. S., et al. Abstract P3-01-10: Ndrg1-egfr axis in inflammatory breast cancer tumorigenesis and brain metastasis. Recherche en cancérologie. 80 (4), 10 (2020).
