염증성 유방암 세포의 꼬리 정맥 주입을 통한 뇌 전이 모델링
Summary
우리는 내인성 HER2 증폭 염증성 유방암 세포주의 꼬리 정맥 주사를 통해 생성된 유방암 뇌 전이의 이종이식 마우스 모델을 설명합니다.
Abstract
뇌로의 전이성 확산은 많은 유형의 암에서 흔하고 파괴적인 징후입니다. 미국에서만 매년 약 200,000명의 환자가 뇌 전이 진단을 받습니다. 원발성 유방암 및 전신 악성 종양 환자의 생존 결과를 개선하는 데 상당한 진전이 있었습니다. 그러나 임상적 뇌 전이 환자의 암울한 예후는 이 치명적인 질병에 대한 새로운 치료제와 전략을 개발해야 할 시급한 필요성을 강조합니다. 적절한 실험 모델의 부족은 뇌 전이, 생물학 및 치료에 대한 우리의 이해를 향상시키는 데 방해가 되는 주요 장애물 중 하나였습니다. 여기에서 우리는 희귀하고 공격적인 형태의 유방암인 염증성 유방암(IBC)에서 유래한 내인성 HER2 증폭 세포주의 꼬리 정맥 주입을 통해 생성된 뇌 전이의 이종이식 마우스 모델을 설명합니다. 반딧불이 루시페라아제와 녹색 형광 단백질로 세포를 표지하여 뇌 전이를 모니터링하고 생물발광 영상, 형광 입체현미경 검사 및 조직학적 평가를 통해 전이성 부담을 정량화했습니다. 마우스는 강력하고 일관되게 뇌 전이를 일으켜 전이 과정에서 주요 매개체를 조사하고 새로운 치료 전략에 대한 전임상 테스트를 개발할 수 있습니다.
Introduction
뇌 전이는 전신 악성 종양의 흔하고 치명적인 합병증입니다. 대부분의 뇌 전이는 폐, 유방 또는 피부의 원발성 종양에서 발생하며, 이는 총체적으로 사례의 67-80 %를 차지합니다 1,2. 뇌 전이 발생률은 100,000건에서 240,000건까지 다양하며, 전이성 암으로 사망한 환자의 경우 부검이 드물기 때문에 이 수치는 과소평가될 수 있다3. 뇌 전이가 있는 환자는 뇌 전이가 없는 환자에 비해 예후가 더 나쁘고 전체 생존율이 낮다4. 뇌 전이에 대한 현재의 치료 옵션은 대체로 완화적이며 대부분의 환자에서 생존 결과를 개선하지 못한다5. 따라서 뇌 전이는 여전히 도전 과제로 남아 있으며 보다 효과적인 치료법을 개발하기 위해 뇌 전이 진행 메커니즘을 더 잘 이해해야 할 필요성이 여전히 시급합니다.
실험 모델의 사용은 뇌로의 유방암 전이성 진행의 특정 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공하고 다양한 치료 접근법의 효능을 평가할 수 있게 했습니다 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . 그러나 뇌 전이 발달의 복잡성을 정확하고 완전하게 요약할 수 있는 모델은 거의 없습니다. 여러 실험 생체 내 모델이 동소, 꼬리 정맥, 심장 내, 경동맥 내 및 뇌내 주사를 포함한 다양한 투여 경로에 의해 암세포를 마우스에 접종하여 생성되었습니다. 각 기술에는 다른 곳에서 검토한 바와 같이 장점과 단점이 있습니다3. 그러나 이러한 마우스 모델 중 어느 것도 뇌 전이의 임상 진행을 완전히 복제할 수 없습니다.
뇌 전이는 드물지만 공격적인 원발성 유방암 변종인 염증성 유방암(IBC) 환자에게 특히 흔합니다. IBC는 유방암 사례의 1 %에서 4 %를 차지하지만 미국에서 유방암 관련 사망의 10 %를 차지합니다17,18. IBC는 빠르게 전이되는 것으로 알려져 있습니다. 실제로, IBC 환자의 3 분의 1은 진단 당시 원격 전이가 있습니다19,20. 뇌 전이와 관련하여, IBC 환자는 비 IBC 환자보다 뇌 전이 발생률이 더 높습니다21. 최근에, 우리는 생쥐 이종이식편에서 IBC 특성을 요약하는 ER-/PR–/HER2+ IBC 환자의 악성 흉막삼출액에서 유래한 MDA-IBC3 세포주가 꼬리 정맥에 의해 주사될 때 생쥐에서 폐 전이보다는 뇌 전이가 발생하는 경향이 향상되어 이 세포주가 뇌 전이의 발달을 연구하는 데 좋은 모델이 됨을 입증했다16.
여기에서 우리는 MDA-IBC3 세포의 꼬리 정맥 주입을 통해 뇌 전이를 생성하고 입체 형광 현미경 및 루시페라아제 이미징을 통해 전이 부담을 평가하는 절차를 설명합니다. 이 방법은 유방암의 뇌 전이의 주요 매개체를 발견하고 치료 적 개입의 효능을 테스트하는 데 사용되었습니다 16,22,23. 이 기술의 단점은 뇌 전이 과정의 모든 단계를 요약하지 않는다는 것입니다. 그럼에도 불구하고 주요 이점으로는 견고성과 재현성, 혈관 내 관련 전이 생물학의 참여, 폐 통과 및 뇌로의 유출, 기술 측면에서 상대적 단순성 등이 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 세포는 생존력을 유지하기 위해 1시간 이상 얼음 위에 보관하지 않아야 합니다. 알코올 면봉은 주사하기 전에 생쥐의 꼬리를 닦는 데 사용해야하며 꼬리 피부가 손상되지 않도록 너무 세게 또는 너무 자주 닦지 않도록주의해야합니다. 쥐가 혈관색전증으로 죽는 것을 방지하기 위해 세포 현탁액에 기포가 없는지 확인하십시오. 꼬리의 혈관이 뚫리…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
원고의 과학적 편집을 위해 MD Anderson 방사선 종양학 부서의 Christine F. Wogan, MS, ELS와 헤마톡실린 및 에오신 염색에 도움을 준 MD Anderson 외과 조직학 코어 부서의 Carol M. Johnston에게 감사드립니다. 동물 연구에 대한 지원에 대해 MD Anderson의 수의학 및 외과 핵심에 감사드립니다. 이 작업은 Susan G. Komen Career Catalyst Research 보조금(BGD에 CCR16377813), American Cancer Society Research Scholar 보조금(RSG-19–126–01 to BGD) 및 텍사스 주 희귀 및 공격적인 유방암 연구 프로그램에 의해 지원되었습니다. 또한 국립 암 연구소 (National Cancer Institute), 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 암 센터 지원 (Core) 보조금 P30 CA016672에서 텍사스 대학교 MD 앤더슨 암 센터까지 부분적으로 지원됩니다.
Materials
| Cell Culture | |||
| 1000 µL pipette tip filtered | Genesee Scientific | 23430 | |
| 10 mL Serological Pipets | Genesee Scientific | 12-112 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 1% |
| Centrifuge tubes 15 mL bulk | Genesee Scientific | 28103 | |
| Corning 500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine | GIBICO Inc. USA | MT10080CV | |
| Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Eppendorf centufuge 5810R | Eppendorf | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBICO Inc. USA | 16000044 | 10% |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers (40 μm) | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1 µg/mL |
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | 5 µg/mL |
| Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| MDA-IBC3 cell lines | MD Anderson Cancer Center | Generated by Dr. Woodward's lab24 | |
| Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid | System Biosciences | BLIV713PA-1 | |
| microtubes clear sterile 1.7 mL | Genesee Scientific | 24282S | |
| Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 23-401C | |
| TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Tail vein injection | |||
| C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J – SCID/Beige | Envigo | SCID/beige mice | |
| BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm) | BD | 328466 | |
| Plas Labs Broome-Style Rodent Restrainers | Plas Labs 551BSRR | 01-288-32A | Order fromThermo Fisher Scientific |
| Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof) | Thermo Fisher Scientific | 50420872 | 70 % used |
| Imaging | |||
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| Disposable PES Filter Units 0.45 µm | Fisherbrand | FB12566501 | filter system to sterilize the D-luciferin |
| D-Luciferin | Biosynth | L8220-1g | stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL |
| 1.7 mL microtube amber | Genesee Scientific | 24-282AM | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC-14043-704-06 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| IVIS 200 | PerkinElmer | machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine | |
| Plastic Containers with Lids | Fisherbrand | 02-544-127 | |
| Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 1000957 | |
| Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
| Stereomicroscope Imaging | |||
| Stereomicroscope AZ100 | Nikon | model AZ-STGE | software NIS-ELEMENT |
| Formalin 10% | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| TC treated dishes 100×20 mm | Genesee Scientific | 25202 |
References
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