التزجيج في البويضات الناضجة في المختبر التي تم جمعها من المبيضين الكبار وprepubertal في الأغنام
Summary
ويهدف البروتوكول إلى توفير طريقة قياسية لتزجيج البويضات الأغنام البالغة والحدث. وهو يشمل جميع الخطوات من إعداد وسائل الإعلام النضج في المختبر لثقافة ما بعد الاحترار. يتم تزجيج البويضات في مرحلة MII باستخدام Cryotop لضمان الحد الأدنى من الحجم الأساسي.
Abstract
في الماشية، يمكن تطوير نظم إنتاج الأجنة في المختبر ومواصلة ذلك بفضل العدد الكبير من المبيضين والبويضات التي يمكن الحصول عليها بسهولة من المسلخ. يحمل المبيضان البالغان دائما العديد من بصيلات النمل ، بينما في المتبرعين قبل البلوغ ، تتوفر الأعداد القصوى من البويضات في عمر 4 أسابيع ، عندما يحمل المبيضان أعدادا كبيرة من بصيلات النمل. وهكذا، تعتبر الحملان 4 أسابيع من العمر المتبرعين جيدة، حتى لو كان الكفاءة التنموية للبويضات prepubertal أقل بالمقارنة مع نظيرتها الكبار.
وستعزز البحوث الأساسية والتطبيقات التجارية بإمكانية نجاح حفظ البويضات الزفيرة التي تم الحصول عليها من المتبرعين البالغين والمتبرعين قبل الاختزال. كما أن تزجيج البويضات التي يتم جمعها من المتبرعين قبل التكاثر سيسمح بتقصير فترة التوليد وبالتالي زيادة المكاسب الوراثية في برامج التربية. ومع ذلك ، فإن فقدان إمكانات النمو بعد التبريد يجعل البويضات الثديية على الأرجح واحدة من أصعب أنواع الخلايا للحفاظ على التبريد. من بين تقنيات التبريد المتاحة ، يتم تطبيق التزجيج على نطاق واسع على البويضات الحيوانية والبشرية. على الرغم من التطورات الأخيرة في هذه التقنية ، فإن التعرض لتركيزات عالية من العوامل الصفية المبردة وكذلك الإصابة المخيفة والإجهاد التناضحي لا يزال يحفز العديد من التعديلات الهيكلية والجزيئية ويقلل من الإمكانات التنموية للبويضات الثديية. هنا، نقوم بوصف بروتوكول لتزجيج البويضات الخرافية التي تم جمعها من المتبرعين الأحداث والبالغين ونضجت في المختبر قبل التبريد. ويشمل البروتوكول جميع الإجراءات من البويضات في النضج في المختبر إلى التزجيج والاحترار وفترة الحضانة بعد الاحترار. يمكن بالفعل تخصيب البويضات المهزوسة في مرحلة MII بعد الاحترار ، ولكنها تحتاج إلى وقت إضافي قبل الإخصاب لاستعادة الضرر بسبب إجراءات التبريد وزيادة إمكاناتها التنموية. وبالتالي، فإن ظروف الثقافة والتوقيت بعد الاحترار هي خطوات حاسمة لاستعادة إمكانات نمو البويضات، خاصة عندما يتم جمع البويضات من المتبرعين الأحداث.
Introduction
يمكن أن يوفر التخزين طويل الأجل للجامات الأنثوية مجموعة واسعة من التطبيقات ، مثل تحسين تربية الحيوانات المنزلية من خلال برامج الاختيار الجيني ، والمساهمة في الحفاظ على التنوع البيولوجي من خلال برنامج الحفاظ على أنواع الحياة البرية في الموقع السابق ، وتعزيز أبحاث وتطبيقات التكنولوجيا الحيوية في المختبر بفضل توافر البويضات المخزنة التي سيتم دمجها في إنتاج الأجنة المختبرية أو برامج زرع الأعضاء النووية1و2و3. كما أن تزجيج البويضات الأحداث سيزيد من الكسب الوراثي عن طريق تقصير فترة التوليد في برامج التربية4. ويعتبر حاليا التزجيج عن طريق التبريد السريع للغاية والاحترار من البويضات نهجا قياسيا للبويضات الماشية cryopreservation5. في المجترات ، قبل التزجيج ، عادة ما تنضج البويضات في المختبر ، بعد استرجاعها من الجريبات التي تم الحصول عليها من المبيضين المشتقة من المسلخ2. الكبار، وخاصة المبيضين prepubertal4،6، يمكن أن توفر في الواقع عدد غير محدود تقريبا من البويضات لتكون cryopreserved.
في الماشية، بعد التزجيج البويضات والاحترار، وقد تم الإبلاغ عن غلة الكيسة الأريمية في >10٪ عادة من قبل العديد من المختبرات خلال العقد الماضي3. ومع ذلك ، في التزجيج البويضات المجترات الصغيرة لا يزال يعتبر جديدا نسبيا لكل من البويضات الأحداث والكبار ، ولا يزال يتعين إنشاء طريقة قياسية لتزجيج البويضاتالخرافية 2،5. على الرغم من التطورات الأخيرة ، فإن البويضات الزخيفة والدافئ تقدم بالفعل العديد من التعديلات الوظيفية والهيكلية التي تحد من إمكاناتها التنموية7و8و9. وهكذا، ذكرت مقالات قليلة تطوير الكيسة الأريمية في 10٪ أو أكثر في البويضات الأغنام vitrified / الدافئة2. وقد تم بحث عدة نهج للحد من التعديلات المذكورة أعلاه: تحسين تكوين حلول التزجيج والذوبان10،11؛ تجريب استخدام أجهزة التبريد المختلفة8،12،13؛ وتطبيق علاجات محددة أثناء نضوج المختبر (IVM)4و14و15 و / أو خلال فترة النقاهة بعد ارتفاع درجة الحرارة6.
هنا نحن نصف بروتوكولا لتزجيج البويضات الأغنام التي تم جمعها من المتبرعين الأحداث والبالغين ونضجت في المختبر قبل cryopreservation. يتضمن البروتوكول جميع الإجراءات من نضوج البويضات في المختبر إلى التزجيج والاحترار وفترة ثقافة ما بعد الاحترار.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن أن يسمح الحفاظ على البويضات في الحيوانات المنزلية ليس فقط بالحفاظ على الموارد الوراثية الأنثوية على المدى الطويل ، ولكن أيضا تطوير التكنولوجيات الحيوية الجنينية. وبالتالي، فإن وضع طريقة قياسية لتزجيج البويضات من شأنه أن يستفيد منه كل من الثروة الحيوانية وقطاع البحوث. في هذا البروتو…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ولم يتلق المؤلفان أي تمويل محدد لهذا العمل. البروفسورة ماريا غرازيا كاباي والدكتورة فاليريا باسيو معترف بامتنان لصوت الفيديو ولإعداد المختبر أثناء صنع الفيديو.
Materials
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
References
- Arav, A. Cryopreservation of oocytes and embryos. Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).
- Mullen, S. F., Fahy, G. M. A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep. Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012).
- Hwang, I. S., Hochi, S. Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), (2007).
- Quan, G., Wu, G., Hong, Q. Oocyte Cryopreservation Based in Sheep: The Current Status and Future Perspective. Biopreservation and Biobanking. 15 (6), 535-547 (2017).
- Succu, S., et al. A recovery time after warming restores mitochondrial function and improves developmental competence of vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 110, (2018).
- Succu, S., et al. Vitrification of in vitro matured ovine oocytes affects in vitro pre-implantation development and mRNA abundance. Molecular Reproduction and Development. 75 (3), (2008).
- Succu, S., et al. Vitrification Devices Affect Structural and Molecular Status of In Vitro Matured Ovine Oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74, 1337-1344 (2007).
- Hosseini, S. M., Asgari, V., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Cytoplasmic, rather than nuclear-DNA, insufficiencies as the major cause of poor competence of vitrified oocytes. Reproductive BioMedicine Online. , (2015).
- Succu, S., et al. Calcium concentration in vitrification medium affects the developmental competence of in vitro matured ovine oocytes. Theriogenology. 75 (4), (2011).
- Sanaei, B., et al. An improved method for vitrification of in vitro matured ovine oocytes; beneficial effects of Ethylene Glycol Tetraacetic acid, an intracellular calcium chelator. Cryobiology. 84, 82-90 (2018).
- Quan, G. B., Wu, G. Q., Wang, Y. J., Ma, Y., Lv, C. R., Hong, Q. H. Meiotic maturation and developmental capability of ovine oocytes at germinal vesicle stage following vitrification using different cryodevices. Cryobiology. 72 (1), 33-40 (2016).
- Fernández-Reyez, F., et al. maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices. Cryobiology. 64 (3), 261-266 (2012).
- Ahmadi, E., Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N., Nazari, H. Antioxidants and glycine can improve the developmental competence of vitrified/warmed ovine immature oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 54 (3), 595-603 (2019).
- Barrera, N., et al. Impact of delipidated estrous sheep serum supplementation on in vitro maturation, cryotolerance and endoplasmic reticulum stress gene expression of sheep oocytes. PLoS ONE. 13 (6), (2018).
- Walker, S. K., Hill, J. L., Kleemann, D. O., Nancarrow, C. D. Development of Ovine Embryos in Synthetic Oviductal Fluid Containing Amino Acids at Oviductal Fluid Concentrations. Biology of Reproduction. 55 (3), 703-708 (1996).
- Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
- Wu, X., Jin, X., Wang, Y., Mei, Q., Li, J., Shi, Z. Synthesis and spectral properties of novel chlorinated pH fluorescent probes. Journal of Luminescence. 131 (4), 776-780 (2011).
- Dell’Aquila, M. E., et al. Prooxidant effects of verbascoside, a bioactive compound from olive oil mill wastewater, on in vitro developmental potential of ovine prepubertal oocytes and bioenergetic/oxidative stress parameters of fresh and vitrified oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Gadau, S. D. Morphological and quantitative analysis on α-tubulin modifications in glioblastoma cells. Neuroscience Letters. 687, 111-118 (2018).
- los Reyes, M. D., Palomino, J., Parraguez, V. H., Hidalgo, M., Saffie, P. Mitochondrial distribution and meiotic progression in canine oocytes during in vivo and in vitro maturation. Theriogenology. , (2011).
- Leoni, G. G., et al. Differences in the kinetic of the first meiotic division and in active mitochondrial distribution between prepubertal and adult oocytes mirror differences in their developmental competence in a sheep model. PLoS ONE. 10 (4), (2015).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), 27-34 (2007).
- Serra, E., Gadau, S. D., Berlinguer, F., Naitana, S., Succu, S. Morphological features and microtubular changes in vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 148, 216-224 (2020).
- Asgari, V., Hosseini, S. M., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes. Theriogenology. 75 (5), 904-910 (2011).
- Ciotti, P. M., et al. Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing. Fertility and Sterility. 91 (6), 2399-2407 (2009).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Naitana, S. Cell Coupling and Maturation-Promoting Factor Activity in In Vitro-Matured Prepubertal and Adult Sheep Oocytes1. Biology of Reproduction. 65 (1), 247-252 (2001).
- Palmerini, M. G., et al. In vitro maturation is slowed in prepubertal lamb oocytes: ultrastructural evidences. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, (2014).
- Leoni, G. G., et al. Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74 (2), 249-257 (2007).
- Succu, S., et al. Effect of vitrification solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes. Theriogenology. 68 (1), 107-114 (2007).
- Larman, M. G., Sheehan, C. B., Gardner, D. K. Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes. Reproduction. 131 (1), 53-61 (2006).
- Yeste, M., Jones, C., Amdani, S. N., Patel, S., Coward, K. Oocyte activation deficiency: a role for an oocyte contribution. Human Reproduction Update. 22 (1), 23-47 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- De Santis, L., et al. Oocyte vitrification: influence of operator and learning time on survival and development parameters. Placenta. 32, 280-281 (2011).
- Zhang, X., Catalano, P. N., Gurkan, U. A., Khimji, I., Demirci, U. Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification. Nanomedicine. 6 (6), 1115-1129 (2011).
