ויטריפיקציה של אין ויטרו התבגר אוציטס שנאספו מן השחלות למבוגרים טרום-פוברטל בכבשים
Summary
הפרוטוקול נועד לספק שיטה סטנדרטית לרטט של ביציות כבשים בוגרות וצעירות. הוא כולל את כל השלבים מהכנת אמצעי ההבשלה במבחנה לתרבות שלאחר ההתחממות. אוציטים עוברים רטט בשלב MII באמצעות Cryotop כדי להבטיח את עוצמת הקול החיונית המינימלית.
Abstract
במשק החי, מערכות ייצור עובר במבחנה ניתן לפתח ומתקיים הודות למספר רב של שחלות וביצים שניתן להשיג בקלות מבית מטבחיים. השחלות הבוגרות נושאות תמיד מספר זקיקי נמלים, ואילו בתורמים לפני גיל ההתבגרות המספרים המקסימליים של ביציות זמינים בגיל 4 שבועות, כאשר השחלות נושאות מספר שיא של זקיקים antral. לכן, כבשים בני 4 שבועות נחשבים לתורמים טובים, גם אם היכולת ההתפתחותית של ביציות טרום-דוקטורט נמוכה יותר בהשוואה למקבילם הבוגר.
מחקר בסיסי ויישומים מסחריים יקודמו על ידי האפשרות של cryopreserving בהצלחה ביציות vitrified שהושגו מתורמים מבוגרים וקדם-פתורליים כאחד. הוויטריפיקציה של ביצית שנאספה מתורמים טרום-פתריאליים תאפשר גם לקצר את מרווח הייצור ובכך להגדיל את הרווח הגנטי בתוכניות הרבייה. עם זאת, אובדן הפוטנציאל ההתפתחותי לאחר cryopreservation עושה ביציות יונקים כנראה אחד מסוגי התאים הקשים ביותר cryopreserve. בין טכניקות ההקפאה הזמינות, רטט מוחל באופן נרחב על ביציות בעלי חיים ובני אדם. למרות ההתקדמות האחרונה בטכניקה, חשיפות לריכוזים גבוהים של סוכנים קריופרוטקטיביים, כמו גם פציעה מצמררת ומתח אוסמוטי עדיין גורמים למספר שינויים מבניים ומולקולריים ומפחיתים את הפוטנציאל ההתפתחותי של ביציות יונקים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול להסתבכות של ביציות כבשים שנאספו מתורמים צעירים ובוגרים והתבגרו במבחנה לפני ההקפאה. הפרוטוקול כולל את כל ההליכים החל מהבשלת ביצית במבחנה ועד תקופת ההזדווגות, ההתחממות והדגירה שלאחר ההתחממות. אוציטים הנבטים בשלב MII אכן יכולים להיות מופרים לאחר ההתחממות, אך הם זקוקים לזמן נוסף לפני ההפריה כדי לשחזר נזק עקב הליכי cryopreservation ולהגדיל את הפוטנציאל ההתפתחותי שלהם. לכן, תנאי תרבות שלאחר ההתחממות ותזמון הם צעדים חיוניים לשיקום הפוטנציאל ההתפתחותי ביצית, במיוחד כאשר ביצית נאספים מתורמים צעירים.
Introduction
אחסון ארוך טווח של הגמטות הנשיות יכול להציע מגוון רחב של יישומים, כגון שיפור הרבייה של בעלי חיים ביתיים על ידי תוכניות בחירה גנטית, תרומה לשימור המגוון הביולוגי באמצעות תוכנית שימור מינים לשעבר של חיות בר, וחיזוק המחקר והיישומים הביוטכנולוגיים במבחנה הודות לזמינות של ביציות מאוחסנות שישולבו בייצור עוברי במבחנה או בתוכניות השתלה גרעינית1,2,3. ויטריפיקציה של ביציות לנוער גם תגדיל את הרווח הגנטי על ידי קיצור מרווח הייצור בתוכניות הרבייה4. רטט על ידי קירור מהיר במיוחד והתחממות של ביציות נחשב כיום גישה סטנדרטית עבור הקפאה ביציות בעלי חיים5. ב הרהורים, לפני vitrification, ביציות הם בדרך כלל התבגרו במבחנה, לאחר אחזור זקיקיים המתקבלים שחלות נגזר בית מטבחיים2. מבוגרים, ובמיוחד השחלות prepubertal4,6, אכן יכול לספק מספר כמעט בלתי מוגבל של ביציות להיות cryopreserved.
בבקר, לאחר ויטריפיקציה של ביציות והתחממות, יבולי בלסטוציסט ב ->10% דווחו בדרך כלל על ידי מספר מעבדות במהלך העשור האחרון3. עם זאת, בהרהורים קטנים oocyte vitrification עדיין נחשב חדש יחסית עבור ביציות נוער ומבוגרים כאחד, שיטה סטנדרטית עבור ויטריפיקציה ביצית כבשים נשאר להקים2,5. למרות ההתקדמות האחרונה, ביצית מחוממת ואכן מציגה מספר שינויים פונקציונליים ומבניים המגבילים את הפוטנציאל ההתפתחותי שלהם7,8,9. לפיכך, מאמרים מעטים דיווחו על התפתחות בלסטוציסט ב 10% או יותר ביציות כבשים מחוממים / מחוממים2. מספר גישות נחקרו כדי להפחית את השינויים שהוזכרו לעיל: אופטימיזציה של הרכב פתרונות vitrification והפשרה10,11; ניסויים בשימוש במכשירי קריו שונים8,12,13; והחלת טיפולים ספציפיים במהלך התבגרות במבחנה (IVM)4,14,15 ו / או במהלך זמן ההחלמה לאחר התחממות6.
כאן אנו מתארים פרוטוקול לרטט של ביציות כבשים שנאספו מתורמים צעירים ובוגרים והתבגרו במבחנה לפני ההקפאה. הפרוטוקול כולל את כל ההליכים החל מהתבגרות ביצית במבחנה ועד לתרבות של ויטריפיקציה, התחממות ותרבות לאחר התחממות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הקפאה של ביציות במשפחה יכולה לאפשר לא רק שימור ארוך טווח של משאבים גנטיים נשיים, אלא גם לקדם את הפיתוח של ביוטכנולוגיה עוברית. לפיכך, פיתוח שיטה סטנדרטית עבור ויטריפיקציה ביצית ינצל הן את בעלי החיים והן את מגזר המחקר. בפרוטוקול זה, מוצגת שיטה מלאה להסתערות ביציות כבשים למבוגרים ויכולה להוו…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים לא קיבלו מימון ספציפי לעבודה זו. פרופסור מריה גרציה Cappai וד”ר ולריה Pasciu הם הודה בהכרת תודה על קריינות וידאו ועל הקמת המעבדה במהלך עשיית וידאו.
Materials
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
References
- Arav, A. Cryopreservation of oocytes and embryos. Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).
- Mullen, S. F., Fahy, G. M. A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep. Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012).
- Hwang, I. S., Hochi, S. Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), (2007).
- Quan, G., Wu, G., Hong, Q. Oocyte Cryopreservation Based in Sheep: The Current Status and Future Perspective. Biopreservation and Biobanking. 15 (6), 535-547 (2017).
- Succu, S., et al. A recovery time after warming restores mitochondrial function and improves developmental competence of vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 110, (2018).
- Succu, S., et al. Vitrification of in vitro matured ovine oocytes affects in vitro pre-implantation development and mRNA abundance. Molecular Reproduction and Development. 75 (3), (2008).
- Succu, S., et al. Vitrification Devices Affect Structural and Molecular Status of In Vitro Matured Ovine Oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74, 1337-1344 (2007).
- Hosseini, S. M., Asgari, V., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Cytoplasmic, rather than nuclear-DNA, insufficiencies as the major cause of poor competence of vitrified oocytes. Reproductive BioMedicine Online. , (2015).
- Succu, S., et al. Calcium concentration in vitrification medium affects the developmental competence of in vitro matured ovine oocytes. Theriogenology. 75 (4), (2011).
- Sanaei, B., et al. An improved method for vitrification of in vitro matured ovine oocytes; beneficial effects of Ethylene Glycol Tetraacetic acid, an intracellular calcium chelator. Cryobiology. 84, 82-90 (2018).
- Quan, G. B., Wu, G. Q., Wang, Y. J., Ma, Y., Lv, C. R., Hong, Q. H. Meiotic maturation and developmental capability of ovine oocytes at germinal vesicle stage following vitrification using different cryodevices. Cryobiology. 72 (1), 33-40 (2016).
- Fernández-Reyez, F., et al. maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices. Cryobiology. 64 (3), 261-266 (2012).
- Ahmadi, E., Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N., Nazari, H. Antioxidants and glycine can improve the developmental competence of vitrified/warmed ovine immature oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 54 (3), 595-603 (2019).
- Barrera, N., et al. Impact of delipidated estrous sheep serum supplementation on in vitro maturation, cryotolerance and endoplasmic reticulum stress gene expression of sheep oocytes. PLoS ONE. 13 (6), (2018).
- Walker, S. K., Hill, J. L., Kleemann, D. O., Nancarrow, C. D. Development of Ovine Embryos in Synthetic Oviductal Fluid Containing Amino Acids at Oviductal Fluid Concentrations. Biology of Reproduction. 55 (3), 703-708 (1996).
- Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
- Wu, X., Jin, X., Wang, Y., Mei, Q., Li, J., Shi, Z. Synthesis and spectral properties of novel chlorinated pH fluorescent probes. Journal of Luminescence. 131 (4), 776-780 (2011).
- Dell’Aquila, M. E., et al. Prooxidant effects of verbascoside, a bioactive compound from olive oil mill wastewater, on in vitro developmental potential of ovine prepubertal oocytes and bioenergetic/oxidative stress parameters of fresh and vitrified oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Gadau, S. D. Morphological and quantitative analysis on α-tubulin modifications in glioblastoma cells. Neuroscience Letters. 687, 111-118 (2018).
- los Reyes, M. D., Palomino, J., Parraguez, V. H., Hidalgo, M., Saffie, P. Mitochondrial distribution and meiotic progression in canine oocytes during in vivo and in vitro maturation. Theriogenology. , (2011).
- Leoni, G. G., et al. Differences in the kinetic of the first meiotic division and in active mitochondrial distribution between prepubertal and adult oocytes mirror differences in their developmental competence in a sheep model. PLoS ONE. 10 (4), (2015).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), 27-34 (2007).
- Serra, E., Gadau, S. D., Berlinguer, F., Naitana, S., Succu, S. Morphological features and microtubular changes in vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 148, 216-224 (2020).
- Asgari, V., Hosseini, S. M., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes. Theriogenology. 75 (5), 904-910 (2011).
- Ciotti, P. M., et al. Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing. Fertility and Sterility. 91 (6), 2399-2407 (2009).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Naitana, S. Cell Coupling and Maturation-Promoting Factor Activity in In Vitro-Matured Prepubertal and Adult Sheep Oocytes1. Biology of Reproduction. 65 (1), 247-252 (2001).
- Palmerini, M. G., et al. In vitro maturation is slowed in prepubertal lamb oocytes: ultrastructural evidences. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, (2014).
- Leoni, G. G., et al. Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74 (2), 249-257 (2007).
- Succu, S., et al. Effect of vitrification solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes. Theriogenology. 68 (1), 107-114 (2007).
- Larman, M. G., Sheehan, C. B., Gardner, D. K. Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes. Reproduction. 131 (1), 53-61 (2006).
- Yeste, M., Jones, C., Amdani, S. N., Patel, S., Coward, K. Oocyte activation deficiency: a role for an oocyte contribution. Human Reproduction Update. 22 (1), 23-47 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- De Santis, L., et al. Oocyte vitrification: influence of operator and learning time on survival and development parameters. Placenta. 32, 280-281 (2011).
- Zhang, X., Catalano, P. N., Gurkan, U. A., Khimji, I., Demirci, U. Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification. Nanomedicine. 6 (6), 1115-1129 (2011).
