Vetrificazione degli ovociti maturi in vitro raccolti da ovaie adulte e prepubertali nelle pecore
Summary
Il protocollo mira a fornire un metodo standard per la vetrificazione degli ovociti ovini adulti e giovani. Include tutti i passaggi dalla preparazione dei mezzi di maturazione in vitro alla cultura post-riscaldamento. Gli ovociti vengono vetrificati allo stadio MII utilizzando Cryotop per garantire il volume essenziale minimo.
Abstract
Nel bestiame, i sistemi di produzione di embrioni in vitro possono essere sviluppati e sostenuti grazie al gran numero di ovaie e ovociti che possono essere facilmente ottenuti da un macello. Le ovaie adulte portano sempre diversi follicoli astrali, mentre nei donatori pre-pubertali il numero massimo di ovociti è disponibile a 4 settimane di età, quando le ovaie portano il picco del numero di follicoli astrali. Pertanto, gli agnelli di 4 settimane sono considerati buoni donatori, anche se la competenza allo sviluppo degli ovociti prepubertali è inferiore rispetto alla loro controparte adulta.
La ricerca di base e le applicazioni commerciali sarebbero potenziate dalla possibilità di crioconservare con successo gli ovociti vetrificati ottenuti da donatori adulti e prepubertali. La vetrificazione degli ovociti raccolti dai donatori prepubertali consentirebbe anche di accorciare l’intervallo di generazione e quindi aumentare il guadagno genetico nei programmi di riproduzione. Tuttavia, la perdita del potenziale di sviluppo dopo la crioconservazione rende gli ovociti dei mammiferi probabilmente uno dei tipi di cellule più difficili da crioconservare. Tra le tecniche di crioconservazione disponibili, la vetrificazione è ampiamente applicata agli ovociti animali e umani. Nonostante i recenti progressi nella tecnica, le esposizioni ad alte concentrazioni di agenti crioprotettivi, nonché lesioni agghiaccianti e stress osmotico inducono ancora diverse alterazioni strutturali e molecolari e riducono il potenziale di sviluppo degli ovociti dei mammiferi. Qui descriviamo un protocollo per la vetrificazione degli ovociti ovini raccolti da donatori giovani e adulti e maturati in vitro prima della crioconservazione. Il protocollo include tutte le procedure, dalla maturazione in vitro degli ovocite alla vetrificazione, al riscaldamento e al periodo di incubazione post-riscaldamento. Gli ovociti vetrificati nella fase MII possono effettivamente essere fecondati dopo il riscaldamento, ma hanno bisogno di più tempo prima della fecondazione per ripristinare i danni dovuti alle procedure di crioconservazione e aumentare il loro potenziale di sviluppo. Pertanto, le condizioni e i tempi della cultura post-riscaldamento sono passi cruciali per il ripristino del potenziale di sviluppo degli ovociti, specialmente quando gli ovociti vengono raccolti da donatori minori.
Introduction
Lo stoccaggio a lungo termine dei gameti femminili può offrire una vasta gamma di applicazioni, come migliorare l’allevamento domestico degli animali mediante programmi di selezione genetica, contribuire a preservare la biodiversità attraverso il programma di conservazione delle specie selvatiche ex situ e aumentare la ricerca e le applicazioni biotecnologiche in vitro grazie alla disponibilità di ovociti immagazzinati da incorporare nella produzione di embrioni in vitro o nei programmi ditrapianto nucleare 1,2,3. La vetrificazione degli ovocite giovanili aumenterebbe anche il guadagno genetico accorciando l’intervallo di generazione nei programmi di riproduzione4. La vetrificazione mediante raffreddamento ultra rapido e riscaldamento degli ovociti è attualmente considerata un approccio standard per la crioconservazione degli ovociti animali5. Nei ruminanti, prima della vetrificazione, gli ovociti vengono solitamente maturati in vitro, dopo il recupero dai follicoli ottenuti dalle ovaie derivate dal mattatoio2. Le ovaie adulte, e in particolare quelle prepubertali4,6, possono effettivamente fornire un numero praticamente illimitato di ovociti da crioconservare.
Nei bovini, dopo la vetrificazione e il riscaldamento degli ovocici, le rese di blastocista al >10% sono state comunemente segnalate da diversi laboratori nell’ultimodecennio 3. Tuttavia, nei piccoli ruminanti la vetrificazione degli ovociti è ancora considerata relativamente nuova sia per gli ovociti giovani che per gli ovociti adulti, e resta da stabilire un metodo standard per la vetrificazione degli ovociti ovini2,5. Nonostante i recenti progressi, l’ovocito vetrificato e riscaldato presenta infatti diverse alterazioni funzionali e strutturali che limitano il loro potenziale disviluppo 7,8,9. Pertanto, pochi articoli hanno riportato uno sviluppo di blastocista al 10% o più negli ovociti ovini vetrificati / riscaldati2. Sono stati studiati vari approcci per ridurre le modifiche di cui sopra: ottimizzazione della composizione delle soluzioni di vetrificazione e discongelamento 10,11; sperimentare l’uso di diversi crio-dispositivi8,12,13; e l’applicazione di trattamenti specifici durante la maturazione in vitro (IVM)4,14,15 e/o durante il tempo di recupero dopo il riscaldamento6.
Qui descriviamo un protocollo per la vetrificazione degli ovociti ovini raccolti da donatori giovani e adulti e maturati in vitro prima della crioconservazione. Il protocollo include tutte le procedure, dalla maturazione in vitro degli ovocite alla vetrificazione, al riscaldamento e al periodo di coltura post-riscaldamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
La crioconservazione degli ovocite negli animali domestici può consentire non solo la conservazione a lungo termine delle risorse genetiche femminili, ma anche lo sviluppo di biotecnologie embrionali. Pertanto, lo sviluppo di un metodo standard per la vetrificazione degli ovocitati andrebbe a vantaggio sia del settore zootecnico che di quello della ricerca. In questo protocollo viene presentato un metodo completo per la vetrificazione degli ovocimi ovini adulti che potrebbe rappresentare un solido punto di partenza per …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori non hanno ricevuto finanziamenti specifici per questo lavoro. La professoressa Maria Grazia Cappai e la Dott.ssa Valeria Pasciu sono riconoscenti per la voce fuori campo video e per aver allevato il laboratorio durante il video making.
Materials
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
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