Summary
Этот протокол описывает использование расширенной ультразвуковой техники для неинвазивного наблюдения и количественной оценки изменений ткани печени в моделях грызунов с неалкогольной жировой болезнью печени.
Abstract
Неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) является состоянием в спектре неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП), которая характеризуется накоплением жира в печени (стеатоз) и воспалением, приводящим к фиброзу. Доклинические модели, близко переименовывающие НАСГ/НАЖБП человека, имеют важное значение для разработки лекарств. В то время как биопсия печени в настоящее время является золотым стандартом для измерения прогрессирования и диагностики НАЖБП / НАСГ в клинике, в доклиническом пространстве для гистологического анализа для оценки стадии заболевания необходим либо сбор целых образцов печени в нескольких временных точках во время исследования, либо биопсия печени.
Проведение биопсии печени в середине исследования является инвазивной и трудоемкой процедурой, а сбор образцов печени для оценки уровня заболевания увеличивает количество исследовательских животных, необходимых для исследования. Таким образом, существует потребность в надежном, переводимом, неинвазивном биомаркере визуализации для обнаружения НАСГ/НАЖБД в этих доклинических моделях. Неинвазивные ультразвуковые изображения B-режима и эластография сдвиговых волн (SWE) могут использоваться для измерения стеатоза, а также фиброза печени. Чтобы оценить полезность SWE в доклинических моделях НАСГ для грызунов, животных поместили на диету с про-НАСГ и подвергли неинвазивной ультразвуковой визуализации B-мод и эластографии сдвиговых волн для измерения гепаторенального (ЧСС) индекса и эластичности печени, измеряя прогрессирование как накопления жира в печени, так и жесткости тканей, соответственно, в нескольких временных точках в течение данного исследования НАЖБП / НАСГ.
Индекс ЧС и показатели эластичности сравнивали с гистологическими маркерами стеатоза и фиброза. Результаты показали сильную корреляцию между индексом HR и процентом окрашивания Oil Red O (ORO), а также между эластичностью и окрашиванием печени Picro-Sirius Red (PSR). Сильная корреляция между классическими методами ex vivo и результатами визуализации in vivo свидетельствует о том, что эластография сдвиговых волн / ультразвуковая визуализация могут быть использованы для оценки фенотипа и прогрессирования заболевания в доклинической модели НАЖБП/НАСГ.
Introduction
Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) является метаболическим состоянием, характеризующимся чрезмерным накоплением жира в печени, и быстро становится ведущим заболеванием печени во всем мире с недавно зарегистрированной глобальной распространенностью 25%1. Неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) является более прогрессирующей стадией спектра НАЖБП, характеризующейся избытком жира печени с прогрессирующим повреждением клеток, воспалением и фиброзом. Эти недуги часто молчат, не обнаруживаются с помощью анализов крови или обычных осмотров, пока не произошло значительное повреждение печени пациента. В настоящее время золотым стандартом для диагностики НАСГ у пациентов является гистологическое исследование образцов биопсии печени, полученных пациентом. Аналогичным образом, доклинические исследователи, которые работают над пониманием патогенеза НАСГ / НАЖБП, а также индустрии разработки лекарств, полагаются на биопсию клина in vivo образцов печени или терминальную эвтаназию спутниковых когорт для гистологии для измерения стеатоза, воспаления и фиброза.
Например, клиновидная биопсия печени была стандартным методом оценки стеатогепатита и фиброза при использовании модели GUBRA NASH2. Метод клиновидной биопсии печени является инвазивным и трудоемким у мелких животных3. Использование клиновидной биопсии печени в середине исследования представляет собой дополнительную экспериментальную переменную в модели заболевания, которая часто увеличивает количество необходимых животных. Учитывая эти факторы, неинвазивные методы визуализации, которые могут быть использованы для надежной оценки стеатоза и фиброза в животных моделях НАСГ / НАЖБВ в ранние моменты времени, оказываются ценными. Эластография сдвиговых волн (SWE) - это ультразвуковой метод, используемый для измерения эластичности мягких тканей. Метод измеряет распространение волн сдвига, создаваемых сверхзвуковыми ультразвуковыми импульсами, направленными на тканевую мишень, а затем вычисляет значение, называемое модулем E4. Скорость волны сдвига пропорциональна степени жесткости тканей.
На рисунках 1 и 2 показана настройка области визуализации и прибор SWE. Прибор SWE представляет собой один колесный блок с двумя экранами и панелью управления, показанный на рисунке 2A. Верхний монитор(рисунок 2B)действует как монитор компьютера и отображает изображения и каталоги пациентов. Панель управления(рисунок 2C)представляет собой массив кнопок и циферблатов, которые управляют общими аспектами захвата изображения: замораживание экрана, сохранение изображений, переход из одного режима в другой. Нижний экран(рисунок 2D)представляет собой сенсорный экран с дополнительными элементами управления для изменения настроек и действует как клавиатура для ввода данных по мере необходимости. Прибор оснащен стилусом для использования на сенсорном экране при желании. Ультразвуковые зонды крепятся к нижней передней панели прибора. Для визуализации B-режима и SWE у грызунов использовался суперлинейный преобразователь от 6 до 20 МГц. Эта способность неинвазивно измерять жесткость тканей делает SWE ценным инструментом для идентификации и постановки фиброза печени5 у пациентов с НАСГ, уменьшая потребность в более инвазивных методах. SWE, фактически, использовался для измерения фиброза печени у пациентов и является одобренным FDA методом оценки фиброза в клинике6. Использование SWE для мониторинга прогрессирования НАСГ на животных моделях заболевания обеспечит трансляционный инструмент для разработки методов лечения и одновременно улучшит благополучие животных за счет сокращения числа животных и совершенствования процедур in vivo для минимизации боли и дистресса.
SWE-визуализация у пациентов с человеческим контролем использует низкочастотный ультразвуковой преобразователь4,который не идеален для мелких животных. Примечательно, что высокочастотные методы SWE были использованы для оценки эффективности ингибирования ацетил-КоА-карбоксилазы на патогенез НАСГ в модели7крыс, и полезность этого метода была описана в тетрахлорметановых крысах, моделях фиброза печени с успешными результатами по сравнению с традиционными методами гистологической оценки METAVIR8. Однако в существующей литературе отсутствует подробная информация о технике и методологии применения визуализации SWE в доклинических моделях НАСГ. Как описано выше, стеатоз печени является одной из ключевых особенностей состояния НАЖБВ/НАСГ и является важным этапом, на котором может быть рассмотрено вмешательство. Таким образом, оценка накопления жира в печени с использованием метода визуализации так же важна, как и оценка фиброза печени в доклинических моделях НАСГ/НАЖБП.
Ультразвуковой метод, известный как индекс ЧС, соотношение яркости тканей печени по сравнению с почечной корой, был использован в качестве суррогатного маркера стеатоза в клинике9,10. Этот подход, однако, не был широко использован в доклинических животных моделях НАЖБЛ/НАСГ. В этой статье описывается метод измерения эластичности, а также индекса ЧСС в качестве суррогатного маркера фиброза и стеатоза печеночной области, соответственно, в модели крыс с дефицитом холина и высоким содержанием жиров (CDAHFD) НАЖБП/НАСГ. Эта модель вызывает быстрый стеатоз, воспаление печени и фиброз, который можно измерить в течение 6 недель у мышей11. Было показано, что добавление холестерина (1%) к этой диете способствует фиброгенезу у крыс12,что делает эту модель подходящим кандидатом для валидационных исследований, включающих визуализацию сдвиговых волн. В целом, эта технология визуализации также может быть применена к широкому спектру моделей / диет НАСГ, где стеатоз и / или фиброз являются конечной точкой интереса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, связанные с животными, были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом pfizer по уходу за животными и их использованию (IACUC) и проведены в международном аккредитованном учреждении AAALAC (Оценка и аккредитация по уходу за лабораторными животными).
1. Индукция заболевания
- Используйте самцов крыс Глиц-Хан (150-175 г; ~ 6-7 недель; всего 40 крыс), которые свободны от известных адвентивных патогенов крыс. Размещайте крыс парами в индивидуально вентилируемой камере с бумажным подстилкой (см. Таблицу материалов)и поддерживайте их при температуре 22 ± 1 °C, относительной влажности 40-70% при цикле 12:12 ч светло-темного.
- Поместите крыс весом 150-175 г (~ 6-7 недель) на холин-дефицитную диету с высоким содержанием жиров с 1% холестерина (n = 20) или стандартный лабораторный грызун-чау (n = 20) в зависимости от дизайна исследования.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании в общей сложности 40 крыс были включены с 20 животными в группе. В конце6-й недели половина когорты из каждой группы была некропсиирована для гистологического анализа образцов печени в середине исследования. Таким образом, размер выборки составил 10 животных на группу за9-ю и 12-ю недельные временные точки.
2. Настройка приборов
- Настройте область визуализации следующим образом: включите нагретую поверхность, чтобы держать животное в тепле во время визуализации (c на рисунке 1),и защищенный конус анестезии носа для доставки ингаляционной анестезии для поддержания плоскости анестезии на протяжении всей процедуры (b на рисунке 1).
- Используйте держатель ультразвукового зонда, чтобы облегчить перемещение ультразвукового зонда в нужное место и предотвратить покои зонда на животное.
- Используйте подогретый ультразвуковой гель на коже, где получено ультразвуковое изображение.
- Поддерживайте следующие настройки на протяжении всей процедуры, которые можно настроить на сенсорном экране: Акустическая мощность 0,0 дБ; Тканевый тюнер 1540 м/с; Динамический диапазон 60 дБ; Диапазон упругости (для режима SWE) < 30 кПа.
- Прикрепите ультразвуковой зонд к рельсовой системе в специализированном держателе (a на рисунке 1).
- Включите прибор и позвольте ему загрузиться. После того, как монитор включен, обратите внимание на изображение режима B с подключенными сведениями о преобразователе.
3. Предметная подготовка
- Убедитесь, что животные голодают по крайней мере за 4 часа до процедуры визуализации, чтобы содержимое кишечника не мешало получению изображения.
- После по крайней мере 4 ч голодания поместите крысу в индукционную камеру изофлуранового анестетика до тех пор, пока не будет достигнут подходящий уровень анестезии, подтвержденный отсутствием реакции на защемление носком. Подвергайте животных воздействию 3-5% изофлурана в течение 3-5 мин, чтобы вызвать анестезию.
- Для поддержания анестезии держите животных под 2-3% изофлурана во время получения изображения. Применяют офтальмологическую мазь для защиты глаз от пересыхания во время анестезии.
- Как только анестезия будет достигнута, извлеките животное из индукционной камеры и поместите его на теплое одеяло с горячей водой. Поместите анестезирующий конус носа над мордой и побрейте животное на правой стороне, от грудной клетки до таза. Используйте химический крем для депиляции, чтобы удалить все оставшиеся волосы в этой области.
- После удаления волос поместите животное в левую боковую клетку с верхними лапами, заклеенными над головой на теплой платформе визуализации(рисунок 3A).
- Нажмите клавишу «Пациент» на панели управления прибором и определите субъекта в соответствии с дизайном исследования.
- Откройте функцию клавиатуры на инструменте, коснувшись значка на сенсорном экране. Введите нужные имена.
- Нажмите Выход, чтобы выйти из экрана имени пациента. Обратите внимание, что B-режим снова открывается на мониторе.
4. Получение изображения для измерения гепато-почечного (ЧГ) индекса
- Нанесите небольшое количество подогретого ультразвукового геля на депилированную область кожи на животном.
- Переместите ультразвуковой зонд, чтобы он коснулся покрытой гелем области субъекта(рисунок 3B). Как только на мониторе появится живое изображение внутренних органов субъекта в B-режиме, переместите ультразвуковой зонд в область немного выше бедра, прямо параллельно поясничным позвонкам (сагиттальная плоскость).
- Используя дисплей B-режима на мониторе, найдите правую почку, определив разделение большой почечной артерии и коры и продолговатого мозга(рисунок 4A). Кроме того, наблюдают за частью печени в единой плоскости изображения.
- Убедитесь, что артефактов изображения практически нет, таких как тени и пузырьки воздуха.
- Измерьте коэффициент B Mode для получения индекса HR.
- Убедитесь, что кора почек и паренхима печени находятся в одной плоскости фокуса. При необходимости отрегулируйте фокусировку и усиление управления для получения четкого изображения.
- Отрегулируйте фокус, повернув ручку фокусировки на панели управления. Отрегулируйте коэффициент усиления, нажав кнопку Auto TGC один раз.
- Нажмите клавишу Freeze на панели управления. Убедитесь, что животное находится между вдохами при замерзании экрана, чтобы избежать размытых изображений.
- Как только экран зависнет, нажмите «Инструменты измерения» на сенсорном экране. Выберите B-mode Ratio, встроенный инструмент, который измеряет относительную яркость ткани из выбранной области, которая представляет интерес. Создайте круг 2 мм, чтобы выбрать интересуящий регион (ROI). Отрегулируйте размер круга, переместив палец вдоль внешнего края трекбола на панели управления.
- Поместите 2 мм круг на изображение печени ROI, которое должно быть расположено справа от почки. Выявляют ткань печени на основании ее однородной эхогенности и гладкого контура.
- Как только круг будет на месте, нажмите кнопку Выбрать на панели управления и наблюдайте за новым появившимся кругом.
- Отрегулируйте размер нового круга до 2 мм, и поместите его на изображение коры почек. Обязательно держите глубину кругов на печени и коре почек одинаковой. Оказавшись на месте, нажмите кнопку Выбрать на панели управления. Обратите внимание, что встроенный системный инструмент отображает индекс HR в виде коэффициента B-режима.
- Нажмите «Сохранить изображение», чтобы сохранить изображение, и просмотрите сохраненные изображения, которые отображаются в виде миниатюр в правой части монитора.
- Нажмите кнопку Freeze на панели управления, чтобы разморозить изображение и вернуться к изображению в режиме B.
- Убедитесь, что кора почек и паренхима печени находятся в одной плоскости фокуса. При необходимости отрегулируйте фокусировку и усиление управления для получения четкого изображения.
- Повторите измерение соотношения B Mode 3 раза на разных глубинах и плоскостях ткани. Рассчитайте среднее значение этих трех соотношений B-мод для каждого животного и точки времени.
5. Получение изображений для эластографии сдвиговых волн
- Переместите зонд поперечно в правую подреберную область, чтобы найти печень с помощью режима B. Найдите область печени, которая в основном паренхима и свободна от крупных кровеносных сосудов, таких как воротная вена и печеночная артерия. Как только чистая область печени была найдена, сгенерируйте карту эластичности сдвига ткани, нажав кнопку SWE на панели управления.
- Отрегулируйте размер и положение коробки SWE под капсулой печени в области, свободной от теней. Определите капсулу как яркую эхогенную линию вблизи верхней части печени.
- Обратите внимание, что поле SWE переходит на цветовую карту в течение 5-10 с. Как только коробка будет заполнена и стабильна, нажмите кнопку Freeze на панели управления, когда животное находится между вдохами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальное количество покрытия коробки должно составлять 60-80%, чтобы точно оценить эластичность печени. - На сенсорном экране нажмите QBox, встроенный системный инструмент, который вычисляет эластичность из ROI на карте упругости волн сдвига. Обратите внимание на круг и поле данных, которые появляются на мониторе. Отрегулируйте положение QBox, коснувшись значка положения на сенсорном экране в нужной настройке.
- Отрегулируйте размер круга до 3 мм, переместив палец вдоль внешнего края трекбола на панели управления. Используя трекбол, расположите круг в области, свободной от тени с равномерной окраской(рисунок 5A,B). Позаботьтесь о том, чтобы избежать известных областей жесткости, таких как кровеносные сосуды или капсула печени, а также кровотечения из этих структур.
- Когда будет найдена адекватная область, нажмите «Сохранить изображение» на панели управления, чтобы сохранить изображение. Повторите эту процедуру 3 раза в разных областях печени. Перемещайте зонд вверх и вниз или вбок на брюшной полости, чтобы собрать изображения, нанесенные на карту SWE, из разных областей печени.
- После того, как все изображения будут собраны, нажмите «Завершить экзамен» на панели управления и запишите экран информации о пациенте, который появляется на мониторе.
- Снимите ленту с лап животного, вытрите лишний гель и удалите животное со стадии визуализации. Позвольте ему восстановиться после анестезии в теплой, сухой клетке самостоятельно, пока он полностью не восстановится. Следите за каждым животным, чтобы обеспечить полное восстановление после анестезии, о чем свидетельствует его способность поддерживать стернальную лежачие состояния.
- Повторите шаги в разделах 4-5 для каждого животного в когорте, которое будет изображено.
6. Поиск и анализ данных изображений
- Когда изображения для всех животных будут собраны, выключите анестезию.
- Чтобы извлечь данные изображения с устройства, нажмите кнопку «Обзор» на панели управления и просмотрите все сканирования, выполненные на этом приборе, которые отображаются на мониторе. Найдите нужные сканы с помощью окна поиска в верхнем углу экрана.
- Выберите все сканы, необходимые для анализа данных, установив флажок рядом с именем пациента с помощью трекбола и кнопки Выбрать. После того, как все необходимые сканы будут выделены, выберите Экспорт JPEG на сенсорном экране. Экспорт данных на сетевой диск или портативный USB-накопитель. Найдите порты USB на задней панели прибора.
- После экспорта файлов откройте отдельные jpg-файлы каждого сканирования на компьютере рабочей станции. Наблюдайте за всеми данными в правой части изображения: B Mode Ratio - соберите число B Ratio; Q Box-соберите значение средней эластичности (кПа).
- Введите все данные в электронную таблицу или другое программное обеспечение для управления базами данных и выполните необходимый статистический анализ.
7. Гистологический анализ образцов печени
- В конце6-й недели выполняют некропсию половине когорты из каждой группы для промежуточного исследования гистологического анализа образцов печени. Аналогичным образом, усыпляют остальную когорту животных и собирают образцы печени для гистологического анализа на12-й неделе.
- Для окрашивания ORO зафиксируйте участки печени в 10% нейтрально-буферном формалине и криоконсервируйте их сахарозой, используя охлажденный 30% раствор сахарозы на ночь как минимум. Крио-встраивание секций в оптимальный температурный компаунд резки и крио-секционирование их на заряженные слайды для подготовки к окрашиванию ORO.
- Поместите криосеки в 100% пропиленгликоль на 2 мин с последующей ночной инкубацией в 0,5% растворе ORO. После удаления из раствора ORO дифференцируют срезы в 85% пропиленгликоле в течение 1 мин, промывают в деионизированной воде и противопоставляют гематоксилин-лилли модификации Майера в течение 1 мин.
- Поместите крышки на горки с помощью водной монтажной среды и высушите их при комнатной температуре.
- Для PSR депарафинизируйте закрепленные формалином, встроенные в парафин слайды печени, поместите их на ночь в жидкость Bouin, а затем окрасьте их с помощью автоматического окрашивателя слайдов в соответствии с протоколом производителя с некоторыми оптимизированными шагами (1% фосфомолибдовой кислоты в течение 5 мин; 0,1% Sirius Red в насыщенной пикриновой кислоте в течение 90 мин; 2 x 30 с промывки в 0,5% уксусной кислоты). Автоматически обезвоживайте слайды, а затем монтируем их с помощью постоянного монтажного носителя.
- Захват изображений слайдов, окрашенных ORO- и PSR, с помощью цифрового микроскопионного сканера с 20-кратным увеличением, сохраните их в формате .svs и сохраните в базе данных изображений менеджера слайдов.
- Анализируйте изображения с помощью пользовательских алгоритмов, созданных в программном обеспечении для цифровой патологии. Единообразно применять цифровые программные приложения для патологии с пороговыми параметрами для идентификации и количественной оценки области сечений печени, а также областей, окрашенных ORO- и PSR. Экспортируйте измерения в электронную таблицу для вычисления процентной области.
8. Статистический анализ
- Выполните статистический анализ данных визуализации с помощью двустороннего ANOVA, используя тест множественных сравнений Сидака для оценки разницы между группами в разные моменты времени. Предположим значительные различия между группами для значений вероятности p ≤ 0,001. Кроме того, выполните корреляцию считываний изображений с гистологическими анализами.
- Используйте непараметрическую статистику для анализа результатов гистологического анализа этого исследования. Заявите значения группы как медиану ± полумесяцвартильном диапазоне (sIQR). Предположим значительные различия между группами для значений вероятности p ≤ 0,001. Используйте тест Манна-Уитни для сравнения количества гистохимического окрашивания PSR и ORO между различными группами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Одной из отличительных черт животных, которых кормят CDAHFD, является стеатоз. Накопление жира в печени изменяет эхогенные свойства ткани, которые можно количественно оценить, измерив яркость печени и нормализовав ее до яркости коры почек по изображению В-мода, сделанному в той же плоскости. Количественное значение выражается в виде индекса ЧС, который является косвенной мерой стеатоза. На рисунке 4Арепрезентативное изображение печени от контрольного животного показывает примерно равную или меньшую яркость (эхогенность) по сравнению с почечной корой. Таким образом, индекс ЧС нормальных животных составляет <1. В этом исследовании средний индекс ЧС контрольных животных в 3-недельный момент времени составляет 0,645 ± 0,03. Напротив, репрезентативное изображение B-режима животного, питаемого CDAHFD(рисунок 4A),показывает повышенную яркость печени по сравнению с почечной корой. В результате индексы HR репрезентативных изображений от пищевых животных CDAHFD составили 1,91 и 1,79 в 6- и 12-недельных временных точках соответственно.
На рисунке 4C показан график показателей HR с течением времени от контрольных и CDAHFD животных. Животные, которых кормят контрольной диетой, показывают незначительное движение в значениях индекса ЧСС от исходного уровня, тогда как животные CDAHFD быстро растут в течение первых 3-6 недель исследования, прежде чем достичь плато. Средний индекс ЧС животных, которые были на диете CDAHFD, составляет 1,861 ± 0,06 по сравнению с 0,328 ± 0,03 у контрольных животных через 12 недель после индукции заболевания. Как и ожидалось, печень показала значительно более высокую положительную процентную площадь окрашивания ORO в группе CDAHFD по сравнению с контрольной группой диеты в 6- (34,81 ± 4,66 против 0,49 ± 0,11) и 12- (30,08 ± 2,64 против 1,17 ± 0,44) недельных временных точек(рисунок 4B,D). Также была выявлена отличная корреляция (Pearson r = 0,78) между процентной площадью окрашивания ORO с индексом HR в 6- и 12-недельных временных точках(рисунок 4E). Эти результаты свидетельствуют о том, что индекс ЧГ может быть ценным считыванием изображений для количественной оценки стеатоза в доклинических моделях НАЖБВ /НАСГ.
Одним из ключевых элементов измерения жесткости печени с помощью SWE является правильное размещение ROI(рисунок 5). На левой панели(рисунок 5А)показано репрезентативное изображение с B-режимом и SWE-картированием печени от животного с контрольной диетой. Правильное размещение ROI должно быть над областью, которая стабильна на цветовой карте и представляет собой измеряемый участок печени, с сигналом, на который не влияют соседние структуры, такие как капсула печени и кровеносные сосуды. Жесткость тканей сообщается как модуль E, который представляет собой расчет, основанный на скорости волны сдвига и определенной константе и выражается в килопаскалях (кПа). Для контрольных животных модуль E находится в диапазоне от 3,5 кПа до 6 кПа. Средний кПа ROI, представленный на рисунке 5A для контрольных животных, составил 4,6 и 5,5 кПа в 6- и 12-недельных временных точках, соответственно, что находится в пределах ожидаемого нормального диапазона. На рисунке 5A показано репрезентативное изображение режима SWE от животного CDAHFD через 6 и 12 недель. Здесь ROI снова был размещен рядом с центром Q Box (карта сдвиговых волн), основываясь на цветной ссылке в верхней части изображения.
Как и ожидалось с этой моделью, модуль E намного выше у животных, питаемых CDAHFD. На этих репрезентативных изображениях средний кПа составлял 10,5 через 6 недель и 23,1 кПа через 12 недель, что указывает на значительную жесткость тканей. Типичное исследование диеты НАСГ с использованием CDAHFD и контрольного чау должно выявить устойчивое прогрессирование жесткости печени из-за фиброза у животных, которых кормили CDAHFD, в то время как контрольные животные остаются прежними. Рисунок 5C показывает постепенное повышение эластичности печени у животных CDAHFD по сравнению со стабильной эластичностью у контрольных животных в течение 12-недельного периода. Контрольная эластичность диеты начинается с 5,80 ± 0,99 кПа в 3-недельный момент времени и не демонстрирует особых изменений (6,14 ± 0,59) в течение 12-недельного исследования. Диета с дефицитом холина, однако, показывает значительное увеличение довольно рано, достигнув 12,07 ± 2,37 кПа к 6 неделе. Тенденция к повышению эластичности продолжается в диете CDAHFD по мере продвижения исследования, достигая 24,43 ± 9,29 кПа через 12 недель после начала специальной диеты.
Образцы печени окрашивали PSR для локализации коллагена в качестве корреляра фиброза. Как и ожидалось в этой модели, у животных CDAHFD наблюдается значительно более высокий процент PSR-положительного окрашивания печени по сравнению с контрольной диетой как в 6-, так и в 12-недельных временных точках(рисунок 5D). Чтобы установить полезность волны сдвига в качестве суррогатного метода для окрашивания ex vivo, числа по модулю E сдвиговой волны были построены против области PSR-окрашивания у крыс CDAHFD на рисунке 5E для определения корреляции. Анализ графика выявил плотный кластер со значением Pearson 'r' 0,88, что указывает на сильную корреляцию. Следует отметить, что результаты, представленные здесь, являются репрезентативными для того, что можно было бы ожидать в исследовании с использованием диеты с дефицитом холина и высоким содержанием жиров для индуцирования НАСГ. Этот метод также может быть использован с другими доклиническими моделями НАСГ; однако это приведет к различным результатам и значениям отсечения в зависимости от протокола индукции заболевания. Как и модель НАСГ крыс, визуализация SWE в модели НАСГ, индуцированной CDAHFD, показала отличную корреляцию между значениями эластичности печени и процентом PSR-положительной окрашенной области в печени13. Таким образом, SWE может быть ценным инструментом для оценки фиброза печени в доклинических моделях НАЖБВ/НАСГ.
Рисунок 1:Настройка образа. Ультразвуковой преобразователь (а) удерживается нисходящей рукой. Стадия визуализации (b) имеет область для зажима шланга анестезии и установки носового конуса (c) для непрерывной анестезии во время визуализации. Сцена также нагревается и оснащена зондами для контроля температуры тела. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Инструмент эластографии сдвиговых волн. (A) Инструмент эластографии сдвиговых волн представляет собой один колесный блок с портами крепления для 4 ультразвуковых зондов. (B)Верхний монитор служит визуальным выходом для просмотра изображений в режиме реального времени, а также отображения данных о пациентах и инвентаризации системы. (C) Центральная панель управления содержит большинство кнопок и ручек, необходимых для настройки дисплея и получения изображений. (D) Нижний монитор представляет собой сенсорный экран с дополнительными элементами управления и командами для получения и настройки изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Позиционирование животных и правильное размещение датчика. (A) После того, как животное было правильно размещено на сцене и удерживалось с помощью ленты в левой боковой лежачем положении(B),ультразвуковой зонд опускается на крысу, касаясь геля, размещенного на животе / боку. Когда зонд касается геля в положении в панели В,почки и печень можно увидеть в сопоставлении на мониторе. Это оптимальное положение для сбора гепато-почечного индекса, а в некоторых случаях и сдвиговых волновых чисел. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Результаты гепато-почечного индекса. (A) Репрезентативное изображение показателей HR у контрольных и CDAHFD диетических крыс в 6- и 12-недельных временных точках. ROI (красный) рисовали в почке (левый круг) и печени (правый круг), затем определяли соотношение сигналов (B Ratio, правая таблица данных). (B) Репрезентативные ОРО-окрашенные гистологические участки образцов печени контрольных и CDAHFD диетических крыс в 6- и 12-недельных временных точках. Шкала баров = 300 мкм.(C)Графическое представление индекса ЧС в течение времени диеты, вызывающей заболевание. Данные контрольных крыс представлены синим цветом, данные о крысах CDAHFD — красным. На графике показаны средние значения со стандартной погрешностью среднего значения (n = 20 в 3-недельный момент времени и n = 20 для контроля и n= 19 для CDAHFD через 6 недель, n = 10 в 9- и 12-недельных временных точках (сравнение контрольного и CDAHFD в каждый момент времени *, **, ***, ****p < 0,001). (D) Расчеты LIVER ORO, построенные для каждой точки времени (n = 10). На графике показаны медианные значения с межквартильным диапазоном (*, ** p < 0,001). (E) График корреляции, сравнивающий процент ОРО-положительной площади печени с индексом ЧС. Сокращения: HR = гепато-почечный; CDAHFD = холин-дефицитная диета с высоким содержанием жиров; ROI = интересуемые регионы; ORO = Oil Red O. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Результаты эластографии сдвиговых волн. (A) Репрезентативное изображение карт SWE от контрольных и CDAHFD диетических крыс в 6- и 12-недельных временных точках. ROI (красный) рисовали в почке (левый круг) и печени (правый круг), затем определяли соотношение сигналов (B Ratio, правая таблица данных). (B) Репрезентативные ОРО-окрашенные гистологические участки образцов печени контрольных и CDAHFD диетических крыс в 6- и 12-недельных временных точках. Шкала шкалы на гистологических участках составляет 300 мкм.(C)Графическое представление жесткости ткани печени в 12-недельной модели крыс НАСГ, индуцированной диетой. Группы кормили нормальной чау(синей) или холин-дефицитной диетой с высоким содержанием жиров (красная) (n = 20 в 3 и 6 недель, n = 10 в 9- и 12-недельных временных точках). На графике показаны средние значения со стандартной погрешностью среднего значения (n = 20 через 3 и 6 недель, n = 10 в 9- и 12-недельных временных точках (сравнение контрольного и CDAHFD в каждый момент времени *, **, *** p < 0,001). (D) Графическое представление распределения коллагена в гистологических образцах печени ex vivo с использованием коллаген-специфического окрашивания PSR (n = 10). На графике показаны медианные значения с межквартильным диапазоном (*, ** P < 0,001)(E)Корреляционный график, сравнивающий процент положительной области окрашивания PSR печени с эластичностью SWE. SWE = эластография сдвиговых волн; CDAHFD = холин-дефицитная диета с высоким содержанием жиров; ROI = интересуемые регионы; ORO = Масло Красное О; НАСГ = безалкогольный стеатогепатит; PSR = Пикро Сириус Ред. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ультразвуковая визуализация, включая SWE, может быть бесценным инструментом для продольной оценки стеатоза печени и жесткости в доклинических моделях НАЖБВ/НАСГ. В этой статье описываются подробные методологии получения высококачественного B-режима, а также SWE-изображений печени для измерения индекса HR и эластичности с использованием CDAHFD диетической модели НАСГ. Далее результаты показывают отличную корреляцию индекса ЧСС и эластичности с золотым стандартом оценки – гистологической оценки ткани печени. Хотя сама процедура представляется несложной, есть некоторые критические аспекты протокола, которые обеспечат успешные результаты.
Размещение датчика является ключевым, особенно при поиске почки для измерения индекса ЧСС в режиме B. Размещение зонда слишком близко к ребрам может привести к тени ребра, что создает ложные меры ультразвукового ослабления. Кроме того, удаление всех волос с использованием крема для бритья и депиляции важно, так как оставшиеся волосы могут захватывать пузырьки воздуха, которые будут отбрасывать тени на изображения b-режима. Наконец, поскольку присутствие пищи в желудке и кишечнике может заслонять печень, особенно у нормальных животных, которых кормят чау, адекватное голодание всех животных имеет решающее значение для успешной визуализации печени.
Хотя измерения эластичности печени из SWE и индекса HR являются ценными показаниями для оценки фиброза и стеатоза печени в доклинических моделях НАСГ, метод имеет несколько ограничений. Такие факторы, как воспаление, застой печени, холестаз и обструкция оттока, влияют на жесткость печени и, таким образом, могут влиять на общую специфичность этого метода измерения фиброза печени8,14,15,16. Аналогичным образом, яркость печени в B-режиме ультразвуковых изображений может зависеть от фиброза и, таким образом, может влиять на точность индекса ЧС при измерении стеатоза. Необходимы дополнительные исследования для уточнения вклада этих влияющих факторов в эластичность и стеатоз и установления значений отсечения для этих считывания в различных доклинических моделях НАСГ. Кроме того, в этом исследовании не оценивалась чувствительность индекса ЧСС как биомаркера для оценки стеатоза печени в доклиническом исследовании эффективности.
Измерение жесткости печени с использованием SWE может стать ценным инструментом для понимания патофизиологии НАСГ / НАЖБЛ, а также для разработки новых методов лечения этого состояния. Позволяя исследователю определять как стеатоз печени, так и жесткость тканей без необходимости инвазивной биопсии, животные в доклинических исследованиях могут контролироваться продольно, а воздействие лекарств на отдельных субъектов может быть количественно определено с течением времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы являются сотрудниками компании Pfizer, Inc.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить команду Pfizer Comparative Medicine Operations Team за их тяжелую работу по управляющей и обеспечивающей здоровье исследуемых животных, а также за помощь с некоторыми методами. Кроме того, спасибо Даниэль Кроуэлл, Гэри Сейтису и Дженнифер Эшли Олсон за их помощь в обработке тканей для гистологического анализа. Кроме того, авторы хотели бы поблагодарить Джулиту Рамирес за рецензирование и предоставление ценных отзывов во время подготовки этой рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aixplorer | Supersonic Imagine | Shear Wave Elastography Instrument | |
| Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer | Supersonic Imagine | Transducer for Shear Wave Elastography | |
| Alpha-dri bedding | rat cages | ||
| Aperio AT2 scanner | Leica Biosystems | Digital Pathology Brightfield Scanner | |
| Compac 6 Anesthesia System | VetEquip | Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however. | |
| Manage Imager Database | Leica Biosystems | Digital Pathology | |
| Mayer's Hematoxilin | Dako/Agilent | H&E Staining/Histology | |
| Nair | Church & Dwight | Hair remover | |
| Oil Red O solution | Poly Scientific | Lipid Staining/Histology | |
| Picrosirius Red Stain (PSR) | Rowley Biochemical | F-357-2 | Collagen Stain/Histology |
| Puralube Opthalmic ointment | Dechra Veterinary Product | Lubrication to prevent eye dryness during anesthesia | |
| Tissue-Tek Prisma Plus | Sakura Finetek USA | Automated slide stainer | |
| VISIOPHARM software | Visiopharm | Digital pathology software | |
| Research Diets | A06071309i | NASH inducing diet | |
| Purina | 5053 | Control animal chow | |
| Vevo imaging station | Fujifilm VisualSonics | The Vevo imaging station is used for holding the ultrasound transducer during imaging. | |
| Wistar Han rats | Charles River Laboratories |
References
- Younossi, Z. M., et al. Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes. Hepatology. 64 (1), 73-84 (2016).
- Boland, M. L., et al. Towards a standard diet-induced and biopsy-confirmed mouse model of non-alcoholic steatohepatitis: Impact of dietary fat source. World Journal of Gastroenterology. 25 (33), 4904-4920 (2019).
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130 (2019).
- Bercoff, J., Tanter, M., Fink, M. Supersonic shear imaging: a new technique for soft tissue elasticity mapping. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 51 (4), 396-409 (2004).
- Bavu, E., et al. Noninvasive in vivo liver fibrosis evaluation using supersonic shear imaging: a clinical study on 113 hepatitis C virus patients. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1361-1373 (2011).
- Ferraioli, G., et al. Accuracy of real-time shear wave elastography for assessing liver fibrosis in chronic hepatitis C: a pilot study. Hepatology. 56 (6), 2125-2133 (2012).
- Ross, T. T., et al. Acetyl-CoA carboxylase inhibition improves multiple dimensions of NASH pathogenesis in model systems. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 829-851 (2020).
- Gu, L. H., Gu, G. X., Wan, P., Li, F. H., Xia, Q. The utility of two-dimensional shear wave elastography and texture analysis for monitoring liver fibrosis in rat model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 20 (1), 46-52 (2020).
- Marshall, R. H., Eissa, M., Bluth, E. I., Gulotta, P. M., Davis, N. K. Hepatorenal index as an accurate, simple, and effective tool in screening for steatosis. American Journal of Roentgenology. 199 (5), 997-1002 (2012).
- Webb, M., et al. Diagnostic value of a computerized hepatorenal index for sonographic quantification of liver steatosis. American Journal of Roentgenology. 192 (4), 909-914 (2009).
- Tous, M., Ferre, N., Camps, J., Riu, F., Joven, J. Feeding apolipoprotein E-knockout mice with cholesterol and fat enriched diets may be a model of non-alcoholic steatohepatitis. Molecular and Cellular Biochemistry. 268 (1-2), 53-58 (2005).
- Kirsch, R., et al. Rodent nutritional model of non-alcoholic steatohepatitis: species, strain and sex difference studies. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (11), 1272-1282 (2003).
- Journal of Ultrasound in Medicine.
- Engelmann, G., Quader, J., Teufel, U., Schenk, J. P. Limitations and opportunities of non-invasive liver stiffness measurement in children. World Journal of Hepatology. 9 (8), 409-417 (2017).
- Piscaglia, F., Salvatore, V., Mulazzani, L., Cantisani, V., Schiavone, C. Ultrasound shear wave elastography for liver disease. a critical appraisal of the many actors on the stage. Ultraschall in der Medizin. 37 (1), 1-5 (2016).
- Singh, S., Loomba, R. Role of two-dimensional shear wave elastography in the assessment of chronic liver diseases. Hepatology. 67 (1), 13-15 (2018).
