Isolatie van muis interstitiële klepcellen om de verkalking van de aortaklep in vitro te bestuderen
Summary
Dit artikel beschrijft de isolatie van muis aortaklepcellen door een twee-stap collagenase procedure. Geïsoleerde muisklepcellen zijn belangrijk voor het uitvoeren van verschillende assays, zoals deze in vitro verkalkingstest, en voor het onderzoeken van de moleculaire paden die leiden tot aortaklepmineralisatie.
Abstract
De verkalking van aortaklepcellen is het kenmerk van aortastenose en wordt geassocieerd met klep cusp fibrose. Klepinterstitiële cellen (VICs) spelen een belangrijke rol in het verkalkingsproces bij aortastenose door de activering van hun dedifferentiatieprogramma naar osteoblastachtige cellen. Muis-VICs zijn een goed in vitro hulpmiddel voor de opheldering van de signaleringsroutes die de mineralisatie van de aortaklepcel stimuleren. De hierin beschreven methode, die met succes door deze auteurs wordt gebruikt, legt uit hoe vers geïsoleerde cellen kunnen worden verkregen. Een tweestaps collagenaseprocedure werd uitgevoerd met 1 mg/ml en 4,5 mg/ml. De eerste stap is cruciaal om de endotheelcellaag te verwijderen en besmetting te voorkomen. De tweede collagenase incubatie is om de migratie van VICs van het weefsel naar de plaat te vergemakkelijken. Bovendien wordt een immunofluorescentiekleuringsprocedure voor de fenotypekarakterisering van de geïsoleerde muisklepcellen besproken. Bovendien werd de verkalkingstest in vitro uitgevoerd met behulp van de calciumreagensmetingsprocedure en alizarinerode kleuring. Het gebruik van primaire kweek van muizenklepcellen is essentieel voor het testen van nieuwe farmacologische doelen om celmineralisatie in vitro te remmen.
Introduction
Verkalkte aortaklepziekte (CAVD) is de meest voorkomende valvulaire hartziekte in westerse populaties en treft bijna 2,5% van de oudere personen ouder dan 65 jaar1. CAVD treft meer dan zes miljoen Amerikanen en wordt geassocieerd met veranderingen in de mechanische eigenschappen van de bijsluiters die de normale doorbloeding van het bloed belemmeren1,2. Momenteel is er geen farmacologische behandeling om de progressie van de ziekte te stoppen of minerale regressie te activeren. De enige effectieve therapie voor de behandeling van CAVD is aortaklepvervanging door chirurgie of transkatheter aortaklepvervanging3. Het is daarom noodzakelijk om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die leiden tot klepmineralisatie om nieuwe farmacologische doelen te identificeren. Inderdaad, niet-behandelde aortastenose heeft verschillende nadelige gevolgen, zoals linkerventrikeldisfunctie en hartfalen4.
De aortaklep bestaat uit drie lagen die bekend staan als fibrosa, spongiosa en ventricularis, die VICs bevatten als het overheersende celtype5. De fibrosa en de ventriculaire zijn bedekt met een laag vasculaire endotheelcellen (VEC’s)5. De VEC’s reguleren de doorlaatbaarheid van ontstekingscellen en paracrinesignalen. Verhoogde mechanische belasting kan de integriteit van de VEC’s aantasten en de homeostase van de aortaklep verstoren, wat leidt tot inflammatoire celinvasie6. Scanning elektronenmicroscopie analyses toonden verstoord endotheel in een menselijke verkalkte aortaklep7.
Histologische analyses van verkalkt weefsel tonen de aanwezigheid van osteoblasten en osteoclasten aan. Bovendien werd osteogene differentiatie van VICs zowel in vitro als in menselijk klepweefsel waargenomen8. Dit proces wordt voornamelijk georkestreerd door de Runt-gerelateerde transcriptiefactor 2 (Runx2) en de botmorfogenetische eiwitten (BMPs)8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol van muisklepcelisolatie voor primaire cultuur. Drie aortakleppen van 8 weken oude muizen werden samengevoegd om een voldoende aantal cellen te verkrijgen. Bovendien beschrijft dit protocol de karakterisering van VIC-fenotype en de in vitro mineralisatietest. De methode is aangepast aan het eerder beschreven protocol uit Mathieu et al.7.
Tijdens de isolatie van aortakleppen moet ervoor worden gezorgd d…
Materials
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
| Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
| Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
References
- Rostagno, C. Heart valve disease in elderly. World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).
- Stewart, B. F., et al. Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study. Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).
- Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. B., Généreux, P. Medical treatment of aortic stenosis. Circulation. 134 (22), 1766-1784 (2016).
- Spitzer, E., et al. Aortic stenosis and heart failure: disease ascertainment and statistical considerations for clinical trials. Cardiac Failure Review. 5 (2), 99-105 (2019).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Simionescu, D. T., Chen, J., Jaeggli, M., Wang, B., Liao, J. Form follows function: advances in trilayered structure replication for aortic heart valve tissue engineering. Journal of Healthcare Engineering. 3 (2), 179-202 (2012).
- Bouchareb, R., et al. Activated platelets promote an osteogenic programme and the progression of calcific aortic valve stenosis. European Heart Journal. 40 (17), 1362-1373 (2019).
- Rutkovskiy, A., et al. Valve interstitial cells: the key to understanding the pathophysiology of heart valve calcification. Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).
- Bosse, Y., Mathieu, P., Pibarot, P. Genomics: the next step to elucidate the etiology of calcific aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 51 (14), 1327-1336 (2008).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
- Richards, J., et al. Side-specific endothelial-dependent regulation of aortic valve calcification: interplay of hemodynamics and nitric oxide signaling. American Journal of Pathology. 182 (5), 1922-1931 (2013).
- Bouchareb, R., et al. Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Janssen, J. W., Helbing, A. R. Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum. European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).
- Ortlepp, J. R., et al. Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis. Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).
