בידוד של תאי שסתום ביניים עכבר ללמוד את הסתיידות של שסתום אבי העורקים במבחנה
Summary
מאמר זה מתאר את הבידוד של תאי שסתום אבי העורקים עכבר על ידי הליך collagenase דו שלבי. תאי שסתום עכבר מבודדים חשובים לביצוע מבדקים שונים, כגון בדיקה זו של הסתיידות במבחנה, ולחקירת המסלולים המולקולריים המובילים מינרליזציה שסתום אבי העורקים.
Abstract
הסתיידות של תאי שסתום אבי העורקים הוא סימן ההיכר של היצרות אבי העורקים והוא קשור פיברוזיס סף שסתום. תאים ביניים שסתום (VICs) לשחק תפקיד חשוב בתהליך הסתיידות היצרות אבי העורקים באמצעות ההפעלה של תוכנית הדיפרנציאציה שלהם לתאים דמויי אוסטאובלסט. עכבר VICs הם כלי במבחנה טובה עבור ההבהרה של מסלולי איתות המניעים מינרליזציה של תא שסתום אבי העורקים. השיטה המתוארת כאן, בשימוש מוצלח על ידי מחברים אלה, מסבירה כיצד להשיג תאים מבודדים טריים. הליך קולגנאז דו-שלטי בוצע עם 1 מ”ג/מ”ל ו-4.5 מ”ג/מ”ל. השלב הראשון הוא חיוני כדי להסיר את שכבת התא אנדותל ולהימנע כל זיהום. הדגירה השנייה של קולגנאז היא להקל על נדידת אח”מים מהרקמה לצלחת. בנוסף, נדון הליך הכתמת אימונופלואורסצנטיות לאפיון הפנוטיפ של תאי שסתום העכבר המבודדים. יתר על כן, בדיקת הסתיידות בוצעה במבחנה באמצעות הליך מדידת ריאגנט סידן והכתמה אדומה alizarin. השימוש בתרבית הראשית של תאי שסתום העכבר חיוני לבדיקת מטרות פרמקולוגיות חדשות לעיכוב מינרליזציה של תאים במבחנה.
Introduction
מחלת שסתום אבי העורקים מסוידת (CAVD) היא מחלת הלב valvular הנפוצה ביותר באוכלוסיות המערביות, המשפיעה על כמעט 2.5% מהקשישים מעל גיל65 . CAVD משפיע על יותר משישה מיליון אמריקאים והוא קשור לשינויים בתכונות המכניות של העלונים הפוגעים בזרימת הדם הרגילה עד1,2. נכון לעכשיו, אין טיפול תרופתי כדי לעצור את התקדמות המחלה או להפעיל רגרסיה מינרלית. הטיפול היעיל היחיד לטיפול CAVD הוא החלפת שסתום אבי העורקים על ידי ניתוח או החלפת שסתום אבי העורקים transcatheter3. לכן חובה לחקור את המנגנונים המולקולריים המובילים מינרליזציה שסתום כדי לזהות מטרות פרמקולוגיות חדשות. אכן, היצרות בוני העורקים שאינה מטופלת יש כמה השלכות שליליות כגון תפקוד לקוי החדר השמאלי ואי ספיקת לב4.
שסתום אבי העורקים מורכב משלוש שכבות המכונות פיברוסה, ספונגיוסה, חדרית, אשר מכילים VICs כמו סוג התא השולט5. הפיברוסה וה חדרית מכוסים בשכבה של תאי אנדותל וסקולריים (VECs)5. VECs לווסת את החדירות של תאים דלקתיים, כמו גם אותות paracrine. מתח מכני מוגבר עשוי להשפיע על שלמות VECs ולהפריע הומאוסטזיס של שסתום אבי העורקים, המוביל לפלישה לתא דלקתי6. סריקת ניתוחי מיקרוסקופיה אלקטרונים הראתה אנדותל משובש בשסתום אבי העורקים מסויד אנושי7.
ניתוחים היסטולוגיים של רקמה מסוידת חושפים את נוכחותם של אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים. יתר על כן, הבחנה אוסטאוגנית של VICs נצפתה הן במבחנה והן ברקמת שסתום אנושי8. תהליך זה מתוזמר בעיקר על ידי גורם שעתוק הקשורים גונט 2 (Runx2) ואת חלבונים מורפוגנטי עצם (BMPs)8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט של בידוד תא שסתום עכבר עבור התרבות הראשית. שלושה שסתומי אבי העורקים מעכברים בני 8 שבועות אוגדו כדי להשיג מספר מספיק של תאים. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר את האפיון של פנוטיפ VIC ואת in vitro mineralization assay. השיטה הותאמה מהפרוטוקול שתואר קודם לכן מאתיו ואח‘7</…
Materials
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
| Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
| Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
References
- Rostagno, C. Heart valve disease in elderly. World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).
- Stewart, B. F., et al. Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study. Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).
- Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. B., Généreux, P. Medical treatment of aortic stenosis. Circulation. 134 (22), 1766-1784 (2016).
- Spitzer, E., et al. Aortic stenosis and heart failure: disease ascertainment and statistical considerations for clinical trials. Cardiac Failure Review. 5 (2), 99-105 (2019).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Simionescu, D. T., Chen, J., Jaeggli, M., Wang, B., Liao, J. Form follows function: advances in trilayered structure replication for aortic heart valve tissue engineering. Journal of Healthcare Engineering. 3 (2), 179-202 (2012).
- Bouchareb, R., et al. Activated platelets promote an osteogenic programme and the progression of calcific aortic valve stenosis. European Heart Journal. 40 (17), 1362-1373 (2019).
- Rutkovskiy, A., et al. Valve interstitial cells: the key to understanding the pathophysiology of heart valve calcification. Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).
- Bosse, Y., Mathieu, P., Pibarot, P. Genomics: the next step to elucidate the etiology of calcific aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 51 (14), 1327-1336 (2008).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
- Richards, J., et al. Side-specific endothelial-dependent regulation of aortic valve calcification: interplay of hemodynamics and nitric oxide signaling. American Journal of Pathology. 182 (5), 1922-1931 (2013).
- Bouchareb, R., et al. Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Janssen, J. W., Helbing, A. R. Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum. European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).
- Ortlepp, J. R., et al. Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis. Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).
