Isolering av mus interstitial ventilceller for å studere forkalkning av aortaventilen in vitro

Summary

Denne artikkelen beskriver isolering av museaortaventilceller ved hjelp av en to-trinns kollagenalensprosedyre. Isolerte museventilceller er viktige for å utføre forskjellige analyser, for eksempel denne in vitro-forkalkningsanalysen, og for å undersøke de molekylære veiene som fører til aortaventilmineralisering.

Abstract

Forkalkning av aortaventilceller er kjennetegnet på aortastenose og er forbundet med ventil cusp fibrose. Ventilinterstitielle celler (VICs) spiller en viktig rolle i forkalkningsprosessen i aortastenose gjennom aktivering av deres dedifferentiasjonsprogram til osteoblastlignende celler. Mouse VICs er et godt in vitro-verktøy for belysning av signalveiene som driver mineraliseringen av aortaventilcellen. Metoden beskrevet heri, vellykket brukt av disse forfatterne, forklarer hvordan du får tak i nyisolerte celler. En to-trinns kollagenalisseprosedyre ble utført med 1 mg/ml og 4,5 mg/ml. Det første trinnet er avgjørende for å fjerne endotelcellelaget og unngå forurensning. Den andre kollagenalinkubasjonen er å lette migreringen av VIC-er fra vevet til platen. I tillegg diskuteres en immunfluorescensfargingsprosedyre for fenotypekarakterisering av de isolerte museventilcellene. Videre ble forkalkningsanalysen utført in vitro ved hjelp av kalsiumreagensmålingsprosedyren og alizarin rød farging. Bruk av museventilcelle primærkultur er avgjørende for å teste nye farmakologiske mål for å hemme cellemineralisering in vitro.

Introduction

Forkalket aortaklaffsykdom (CAVD) er den mest utbredte valvulære hjertesykdommen i vestlige populasjoner, som påvirker nesten 2,5% av eldre personer over 65 år¹. CAVD påvirker over seks millioner amerikanere og er forbundet med endringer i de mekaniske egenskapene til brosjyrene som svekker normal blodstrøm^{gjennomstrømning 1,2}. For tiden er det ingen farmakologisk behandling for å stoppe sykdomsprogresjonen eller for å aktivere mineralregresjon. Den eneste effektive behandlingen for å behandle CAVD er aortaventilutskifting ved kirurgi eller transkateter aortaventil erstatning³. Det er derfor viktig å undersøke molekylære mekanismer som fører til ventilmineralisering for å identifisere nye farmakologiske mål. Faktisk har ikke-behandlet aortastenose flere negative konsekvenser som venstre ventrikel dysfunksjon og hjertesvikt⁴.

Aortaventilen består av tre lag kjent som fibrosa, spongiosa og ventrikulæris, som inneholder VICer som den dominerende celletypen⁵. Fibrosa og ventrikkel er dekket av et lag av vaskulære endotelceller (VECer)⁵. VECene regulerer permeabiliteten til inflammatoriske celler samt parakrinesignaler. Økt mekanisk stress kan påvirke integriteten til VECene og forstyrre homeostase av aortaventilen, noe som fører til inflammatorisk celleinvasjon⁶. Skanning av elektronmikroskopianalyser viste forstyrret endotel i en menneskelig forkalket aortaventil⁷.

Histologiske analyser av forkalket vev avslører tilstedeværelsen av osteoblaster og osteoklaster. Videre ble osteogen differensiering av VICs observert både in vitro og i humant ventilvev⁸. Denne prosessen er hovedsakelig orkestrert av Runt-relatert transkripsjonsfaktor 2 (Runx2) og benmorfogenetiske proteiner (BMPer)^8,9.

Protocol

MERK: Alle dyreprosedyrer som er beskrevet her, er godkjent av Icahn School of Medicine ved Mount Sinai institusjonelle kjerne- og brukskomité. 1. Klargjøring før ventilcelleisolasjon fra voksne mus Rengjør og steriliser alle kirurgiske instrumenter som er vist i figur 1A ved å bruke 70 % v/v etanol og deretter autoklavere dem i 30 min. Rengjør det kirurgiske arbeidsområdet med 70 % etanol. Tilsett 500 μL penicillin-streptomycin til 50 …

Representative Results

Siden murine aortaventiler vanligvis er 1 mm i diameter, må minst tre ventiler samles for å samle en million levedyktige celler for forskjellige eksperimentelle prosedyrer. De ulike trinnene i VIC-isolasjonsprosessen er vist i figur 1 og figur 2. Siden det er vanskelig å skrape ventilvevet manuelt, er det å foretrekke å bruke skjærspenning opprettet ved vortexing for å fjerne VECene. Faktisk viste CD31 immunfluorescence farging resultater fraværet av end…

Discussion

Denne artikkelen presenterer en detaljert protokoll for museventilcelleisolasjon for primærkultur. Tre aortaventiler fra 8 uker gamle mus ble samlet for å oppnå et tilstrekkelig antall celler. I tillegg beskriver denne protokollen karakteriseringen av VIC fenotype og in vitro mineraliseringsanalysen. Metoden ble tilpasset fra den tidligere beskrevne protokollen fra Mathieu et al.⁷.

Under isolering av aortaventiler må det tas hensyn til å unngå a…

Materials

3 mm cutting edge scissors	F.S.T	15000-00
Anti-alpha smooth muscle Actin antibody	abcam
Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate	Cell Signaling	4412
Arsenazo-III reagent set	POINT SCIENTIFIC	C7529-500	a Kit to measure the concentration of calcium
Bonn Scissors	F.S.T	14184-09
Calcium hydroxide	SIGMA -Aldrich 31219	31219
CD31	Novusbio
Collagenase type I  (125 units/mg)	Thermofisher Scientific	17018029
DMEM	Tthermofisher	11965092
Extra fine graefe forceps	F.S.T	11150-10
FBS	Gibco 16000044
Fine forceps	F.S.T Dumont
HCl	SIGMA-ALDRICH	H1758
HEPES 1 M solution	STEMCELLS TECHNOLOGIES
L-Glutamine 100x	Thermofisher Scientific	25030081
Mycozap	Lanza	VZA-2011	Mycoplasma elimination reagent
PBS 10x	SIGMA-ALDRICH
penecillin streptomycin 100x	Thermofisher Scientific	10378016
Sodium Pyruvate 100 mM	Thermofisher Scientific	11360070
Standard pattern forceps	F.S.T	11000-12
Surgical Scissors – Sharp-Blunt	F.S.T	14008-14
Trypsin 0.05%	Thermofisher Scientific	25300054
Vimentin	abcam