Aort Kapak In Vitro Kalsifikasyonu Çalışmak için Fare Interstisyel Kapak Hücrelerinin İzolasyonu
Summary
Bu makalede, fare aort kapak hücrelerinin iki adımlı bir kollajenaz prosedürü ile izolasyonu açıklanmaktadır. İzole fare valf hücreleri, bu in vitro kireçlenme tahlilleri gibi farklı tahlillerin yapılması ve aort kapak mineralizasyonuna yol açan moleküler yolların araştırılması için önemlidir.
Abstract
Aort kapak hücrelerinin kireçlenmesi aort darlığı ayırt edici özelliğidir ve kapak cusp fibrozisi ile ilişkilidir. Kapak geçiş hücreleri (VC’ler), aort darlığında kireçlenme sürecinde osteoblast benzeri hücrelere ayırıcı programlarının aktivasyonu ile önemli bir rol oynar. Fare VIC’leri, aort kapak hücresinin mineralizasyonunu yönlendiren sinyal yollarının aydınlatılması için iyi bir in vitro araçtır. Burada açıklanan yöntem, bu yazarlar tarafından başarıyla kullanılan, taze izole hücrelerin nasıl elde edildiğini açıklar. 1 mg/mL ve 4.5 mg/mL ile iki aşamalı kollajenaz işlemi yapıldı. İlk adım, endotel hücre tabakasını çıkarmak ve herhangi bir kirlenmeyi önlemek için çok önemlidir. İkinci kollajenaz inkübasyonu, VC’lerin dokudan plakaya geçişini kolaylaştırmaktır. Ayrıca izole edilmiş fare valf hücrelerinin fenotip karakterizasyonu için bir immünofluoresans boyama prosedürü tartışılmıştır. Ayrıca kalsiyum reaktif ölçüm işlemi ve alizarin kırmızısı lekelenme kullanılarak kireçlenme tahlil in vitro olarak gerçekleştİrilmiştir. Fare kapak hücresi birincil kültürünün kullanımı, hücre mineralizasyon in vitrosunu inhibe etmek için yeni farmakolojik hedeflerin test edilmesi için gereklidir.
Introduction
Kireçlenmiş aort kapak hastalığı (CAVD), 65 yaş üstü yaşlı bireylerin yaklaşık% 2,5’ini etkileyen batı popülasyonlarında en yaygın valvüler kalphastalığıdır. CAVD altı milyondan fazla Amerikalıyı etkiler ve normal kan akışını bozan broşürlerin mekanik özelliklerindeki değişikliklerle ilişkilidir1,2. Şu anda hastalığın ilerlemesini durdurmak veya mineral gerilemesini aktive etmek için farmakolojik bir tedavi yoktur. CAVD tedavisinde tek etkili tedavi cerrahi veya transktheter aort kapak replasmanı ile aort kapak değişimi3′ dür. Bu nedenle, yeni farmakolojik hedefleri belirlemek için kapak mineralizasyonuna yol açan moleküler mekanizmaların araştırılması zorunludur. Gerçekten de, tedavi edilmeyen aort darlığı sol ventrikül disfonksiyonu ve kalp yetmezliği gibi birkaç olumsuz sonucu vardır4.
Aort kapakçığı fibrosa, spongiosa ve ventrikülaris olarak bilinen ve vic’leri baskın hücre tipi5olarak içeren üç katmandan oluşur. Fibrosa ve ventriküller bir damar endotel hücreleri (VC) tabakası ile kaplıdır5. GC’ler, enflamatuar hücrelerin ve parakrin sinyallerin geçirgenliğini düzenler. Artan mekanik stres, VC’lerin bütünlüğünü etkileyebilir ve aort kapakçığının homeostazını bozabilir ve enflamatuar hücre istilasına yol açabilir6. Taramalı elektron mikroskopi analizleri, insan kireçlenmiş aort kapağında endotelin bozulduğunu göstermiştir7.
Kireçlenmiş dokunun histolojik analizleri osteoblastların ve osteoklastların varlığını ortaya koymaktadır. Ayrıca, VC’lerin osteojenik farklılaşması hem in vitro hem de insan kapak dokusunda gözlenmiştir8. Bu işlem esas olarak Runt ile ilgili transkripsiyon faktörü 2 (Runx2) ve kemik morfogenetik proteinleri (BMP’ler) 8,9tarafından düzenlenir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, birincil kültür için fare valfi hücre yalıtımının ayrıntılı bir protokolü sunulmaktadır. 8 haftalık farelerden alınan üç aort kapakçığı, yeterli sayıda hücre elde etmek için birikti. Ek olarak, bu protokol VIC fenotipinin karakterizasyonu ve in vitro mineralizasyon testini açıklar. Yöntem, Mathieu ve ark.7‘den daha önce açıklanan protokolden uyarlanmıştır.
Aort kapaklarının izolasyonu sırasında, hücrel…
Materials
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
| Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
| Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
References
- Rostagno, C. Heart valve disease in elderly. World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).
- Stewart, B. F., et al. Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study. Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).
- Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. B., Généreux, P. Medical treatment of aortic stenosis. Circulation. 134 (22), 1766-1784 (2016).
- Spitzer, E., et al. Aortic stenosis and heart failure: disease ascertainment and statistical considerations for clinical trials. Cardiac Failure Review. 5 (2), 99-105 (2019).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Simionescu, D. T., Chen, J., Jaeggli, M., Wang, B., Liao, J. Form follows function: advances in trilayered structure replication for aortic heart valve tissue engineering. Journal of Healthcare Engineering. 3 (2), 179-202 (2012).
- Bouchareb, R., et al. Activated platelets promote an osteogenic programme and the progression of calcific aortic valve stenosis. European Heart Journal. 40 (17), 1362-1373 (2019).
- Rutkovskiy, A., et al. Valve interstitial cells: the key to understanding the pathophysiology of heart valve calcification. Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).
- Bosse, Y., Mathieu, P., Pibarot, P. Genomics: the next step to elucidate the etiology of calcific aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 51 (14), 1327-1336 (2008).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
- Richards, J., et al. Side-specific endothelial-dependent regulation of aortic valve calcification: interplay of hemodynamics and nitric oxide signaling. American Journal of Pathology. 182 (5), 1922-1931 (2013).
- Bouchareb, R., et al. Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Janssen, J. W., Helbing, A. R. Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum. European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).
- Ortlepp, J. R., et al. Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis. Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).
