슈도모나스 아에루기노사 감염 모델의 실시간 평가를 위한 도구
Summary
합성 낭포성 섬유증 가래 배지(SCFM2)는 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 및 형광 활성화 세포 분류와 함께 사용하여 고해상도에서 세균 응고체를 관찰할 수 있다. 이 논문은 향후 연구를 위한 플랫폼으로서 항균 치료 중 집계 인구를 평가하는 방법을 자세히 설명합니다.
Abstract
슈도모나스 아에루기노사(Pa)는 낭포성 섬유증(CF)과 관련된 가장 흔한 기회성 병원균 중 하나입니다. 일단 Pa 식민지가 확립되면, 감염박테리아의 큰 비율은 기도 가래 내의 생물막을 형성합니다. CF 가래로부터 분리된 Pa 생물막은 공간적으로 조직되고 항균 내성과 같은 임상적으로 관련된 표현형을 나타내는 ~ 10-1,000개의 세포의 작고 조밀한 응집체에서 성장하는 것으로 나타났습니다. Pa aggregates가 변화하는 가래 환경에 어떻게 반응하는지 연구하는 가장 큰 과제 중 하나는 집계 형성을 촉진하는 영양적으로 관련성이 있고 견고한 시스템이 부족하다는 것입니다. 합성 CF 가래 매체(SCFM2)를 사용하여 Pa 골재의 수명 기록은 단일 셀의 해상도에서 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사(CLSM) 및 이미지 분석을 사용하여 관찰될 수 있다. 이 체외 계통은 실시간으로, 3 차원, 그리고 미크론 규모에 다양한 크기의 집계의 수천의 관찰을 할 수 있습니다. 개인 및 인구 수준에서, 표현형 및 위치에 의해 골재를 그룹화하는 능력을 갖는 것은 다른 발달 단계에서 골재의 관찰과 항생제 치료와 같은 미세 환경의 변화에 대한 반응을 정밀하게 분화할 수 있도록 용이하게 한다.
Introduction
슈도모나스 아에루기노사(Pa)는 면역이 손상된 개인에 있는 만성 감염을 설치하는 기회성 병원체입니다. 유전 질환 낭포성 섬유증 (CF)을 가진 사람들을 위해, 이 감염은 일생의 과정을 걸이 수 있습니다. CF는 시간이 지남에 따라 다양한 미생물 병원균에 의해 식민지화되는 기도에 점성영양이 풍부한 가래의 축적을 유발합니다. Pa는 가장 널리 퍼진 CF 병원체 중 하나이며, 어린 시절에 기도를 식민지화하고 치료하기 어려운 감염1을확립합니다. Pa는 중요한 임상 문제로 남아 있으며 최근2,3에서개선 된 치료 요법에도 불구하고 CF를 가진 사람들의 사망의 주요 원인으로 간주됩니다. 이러한 지속성 표현형과 항생제 내성이 증가하는 Pa는 새로운 치료 전략인 ESKAPE 병원균4의개발을 위한 연구 우선 순위로서 질병통제센터(CDC)와 세계보건기구(WHO)에 의해 확인된 병원균 군에서 Pa를 한 자리에 얻었다.
다른 ESKAPE 병원체와 마찬가지로, 취득한 항생제 내성은 Pa에서일반적이지만 Pa 항균 내성에도 기여하는 많은 본질적인 특성이 있습니다. 이들 중에서도 PA가 CF 환자 가래5,6을포함하여 다중 감염에서 관찰될 수 있는 ~10-1,000개의 세포의 고밀도 클러스터를 형성하는 능력이 있다. 다른 생물막 시스템에서 연구된 Pa 와 마찬가지로, Pa 골재는 항생제에 대한 내성 증가 및 세포 세포 통신의 활성화(쿼럼 센싱(QS)와 같은 임상적으로 관련된 표현형을 표시합니다. 예를 들어, Pa의 골재는 다른 미생물에 대항하고 피오시닌7의생산과 같은 항균 치료를 용인하기 위해 QS 조절 된 행동을 사용하는 것으로 나타났습니다. 이러한 행동을 연구하는 능력은 인체에 존재하는 것과 유사한 환경에서 세균 생태계에 대한 흥미로운 통찰력을 제공합니다.
Pa aggregates가 변화하는 가래 환경에 어떻게 반응하는지 연구하는 가장 큰 과제 중 하나는 집계 형성을 촉진하는 영양적으로 관련성이 있고 견고한 시스템이 부족하다는 것입니다. Pa에 대해 알려진 많은 것은 세포가 플랑크톤또는 생체 내에서 관찰되지 않은 특징적인 표면 부착된 “버섯” 아키텍처에서 자라는 체외 시스템을 사용하여 발견되었습니다. 유량 세포 또는 고체 천과 같은 고전적인 생물 막 성장 모델은 세균성 행동과 항생제 내성의 메커니즘에 대한 광범위하고 귀중한 지식을 산출했지만, 이러한 사실 인정은 항상 생체 내에서 번역되지 않습니다. 많은 시험관 내 모델은 인간 감염 부위의 성장 환경을 모방하는 제한된 능력을 가지고 있으며 생체 내 연구에 비용이 많이 듭니다. 차례로, 많은 생체 내 모델은 시험관 내 기술에 의해 제공되는 유연성과 해상도가 부족합니다.
합성 낭포성 섬유증 가래 (SCFM2)는 CF 폐에서 만성 감염 시 경험한 것과 유사한 Pa 성장을위한 환경을 제공하도록 설계되었습니다. SCFM2에는 뮤신, 지질 및 DNA 외에도 예상되는 CF 스푸타에서 확인된 영양 공급원이 포함됩니다. SCFM2의 Pa 성장은 실제 가래의 성장에 필요한 거의 동일한 유전자를 필요로 하며 천연 Pa 골재 형성9,10을지원합니다. 접종 후, 판자 세포는 확장을 통해 크기가 증가하는 응집체를 형성합니다. 개별 셀(이민자라고 함)은 골재에서 방출되고, 콜로니언 영역으로 마이그레이션하고, 새로운골재(10)를형성한다. 이러한 생명 기록은 단일 셀의 해상도에서 CLSM 및 이미지 분석을 사용하여 관찰할 수 있습니다. SCFM2에서 형성된 Pa의 응집체는 CF폐(10)에서관찰된 것과 유사한 크기이다. 이 모델을 사용하면 미크론 스케일에서 실시간으로 다양한 크기의 여러 응집체를 실시간으로 3차원에서 관찰할 수 있습니다. 시간 경과 현미경 검사법은 한 실험에서 수천(~50,000개)의 응집체를 추적할 수 있게 해줍니다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하면 개별 집계 및 인구 수준에서 가장 가까운 0.1 μm에 대한 3차원의 집계 부피, 표면적 및 위치를 포함하여 현미경 그래프에서 집계 표현형의 정량화를 허용합니다. 표현형 및 위치에 의해 응집체를 그룹화할 수 있는 능력을 갖는 것은 변화하는 마이크로환경에 대한 반응뿐만 아니라 변화하는 마이크로환경에 대한 반응뿐만 아니라 정밀하게 다른 발달 단계에서 골재를 분화할 수 있게 한다6,11.
SCFM2를 적용하여 낮은 볼륨과 높은 처리량 분석으로 Pa 집계를 연구하면 유연하고 비용 효율적인 모델이 됩니다. 정의된 매체로서 SCFM2는 여러 플랫폼에서 균일성과 재현성을 제공하여 체외9에서 Pa 골재를 연구하는 영양및 신체적 관련 방법을 제공합니다. 응용 프로그램은 CLSM과 함께 고해상도에서 공간 조직 및 항생제 내성을 관찰하는 사용을 포함한다 (이 방법 종이에 설명된 바와 같이). 실시간 미크로네 규모의 데이터를 제공하는 실험을 수행하는 능력은 생체 내에서 발생할 수 있는 종 내 및 종 간 상호 작용에대한 연구를 가능하게 합니다. 예를 들어, SCFM2는 이전에 Pa가 이용한 시스템 네트워크를 통해 복합 체내 통신의 공간 역학을 연구하여 독성 및 발병률6에기여하는 다중 유전자를 조절하는 데 사용되어 왔다.
그림 1: 주요 실험 단계의 그래픽 묘사. (A)SCFM2는 Pa 세포로 접종되어 유리 바닥 배양 접시에 골재를 형성할 수 있습니다. (B)골재는 공초점 현미경으로 옮겨지고 항생제가 첨가된다. 묘사된 3개의 기술 복제(챔버 1-3) 및 항생제 처리 없이 접종된 SCFM2의 제어 우물(4)이 묘사된다. 골재는 18h.(C)초기 18h 이미징 후 CLSM을 사용하여 이미지화되며, 골재는 죽은 세포를 시각화하기 위해 프로피듐 요오드로 처리되고 CLSM(D) 원하는 표현형을 사용한 골재는 FACS를 사용하여 SCFM2로부터 분리된다. 약어: SCFM2 = 합성 낭포성 섬유증 가래 배지; Pa = 슈도모나스 아루기노사; CLSM = 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사; FACS = 형광 활성화 셀 정렬. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
여기서, SCFM2의 실용성은 실시간으로 Pa 골재에 대한 항생제 치료의 영향을 연구하는 것이 입증되고, 다운스트림 분석을 위한 뚜렷한 표현형을 가진 골재의 집단을 격리하기 위한 세포 선별 접근법의 사용(그림1).
Protocol
Representative Results
Discussion
이 작품은 항생제 치료의 존재와 부재에서 세균 성 집계 인구를 연구하기 위해 결합 될 수있는 방법론을 도입했다. 고해상도 CLSM은 항생제에 노출될 때 골재의 변화와 실시간으로 응집물의 구조적 방향을 시각화할 수 있게 합니다. 또한, 항생제로 치료 한 후 남아있는 바이오매스의 물리적 및 구조적 특징은 RNA-seq를 활용한 미래 유전자 발현 연구와 이러한 관찰을 상호 연관시키는 것을 목표로 정?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.E.D는 분자 의학과, 사우스 플로리다 대학, N.I.H (5R21AI147654 – 02 (PI, 첸) 및 미생물군유전체에 대한 USF 연구소에서 제공하는 창업 기금에 의해 지원됩니다. 이 원고와 관련된 데이터 세트와 관련된 지속적인 협업에 대해 Whiteley 연구소에 감사드립니다. FACS 분류를 촉진해 주신 찰스 세케레스 박사에게 감사드립니다. 수치는 Biorender.com 사용하여 A.D.G와 S.E.D에 의해 만들어졌습니다.
Materials
| Amino acids | |||
| Alanine | Acr s Organics |
56-41-7 | |
| Arginine HCl | MP | 1119-34-2 | |
| Asparagine | Acrs Organics |
56-84-8 | Prepared in 0.5 M NaOH |
| Cystine HCl | Alfa Aesar | L06328 | |
| Glutamic acid HCl | Acrs Organics |
138-15-8 | |
| Glycine | Acrs Organics |
56-40-6 | |
| Histidine HCl H2O | Alfa Aesar | A17627 | |
| Isoleucine | Acrs Organics |
73-32-5 | |
| Leucine | Alfa Aesar | A12311 | |
| Lysine HCl | Alfa Aesar | J62099 | |
| Methionine | Acrs Organics |
63-68-3 | |
| Ornithine HCl | Alfa Aesar | A12111 | |
| Phenylalanine | Acrs Organics |
63-91-2 | |
| Proline | Alfa Aesar | A10199 | |
| Serine | Alfa Aesar | A11179 | |
| Threonine | Acrs Organics |
72-19-5 | |
| Tryptophan | Acrs Organics |
73-22-3 | Prepared in 0.2 M NaOH |
| Tyrosine | Alfa Aesar | A11141 | Prepared in 1.0 M NaOH |
| Valine | Acrs Organics |
72-18-4 | |
| Antibiotic | |||
| Carbenicillin | Alfa Aesar | J6194903 | |
| Day-of Stocks | |||
| CaCl2 * 2H2O | Fisher Chemical | C79-500 | |
| Dextrose (D-glucose) | Fisher Chemical | 50-99-7 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Fisher (Avanti Polar Lipids) | 4235-95-4 | shake 15-20 min at 37 °C to evaporate chloroform |
| FeSO4 * 7H2O | Acrs Organics |
7782-63-0 | this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh |
| L-lactic acid | Alfa Aesar | L13242 | pH stock to 7 with NaOH |
| MgCl2 * 6H2O | Acrs Organics |
7791-18-6 | |
| N-acetylglucosamine | TCI | A0092 | |
| Prepared solids | |||
| Porcine mucin | Sigma | M1778-100G | UV-sterilize |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen | 15632-011 | |
| Stain | |||
| Propidium iodide | Alfa Aesar | J66764MC | |
| Salts | |||
| K2SO4 | Alfa Aesar | A13975 | |
| KCl | Alfa Aesar | J64189 | add solid directly to buffered base |
| KNO3 | Acrs Organics |
7757-79-1 | |
| MOPS | Alfa Aesar | A12914 | add solid directly to buffered base |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | add solid directly to buffered base |
| Na2HPO4 | RPI | S23100-500.0 | |
| NaH2PO4 | RPI | S23120-500.0 | |
| NH4Cl | Acrs Organics |
12125-02-9 | add solid directly to buffered base |
| Consumables | |||
| Conical tubes (15 mL) | Olympus plastics | 28-101 | |
| Conical tubes (50 mL) | Olympus plastics | 28-106 | |
| Culture tubes w/air flow cap | Olympus plastics | 21-129 | |
| 35 mm four chamber glass-bottom dish | CellVis | NC0600518 | |
| Luria Bertani (LB) broth | Genessee Scientific | 11-118 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Bioreagents | BP2944100 | |
| Pipet tips (p200) | Olympus plastics | 23-150RL | |
| Pipet tips (p1000) | Olympus plastics | 23-165RL | |
| Serological pipets (5 mL) | Olympus plastics | 12-102 | |
| Serological pipets (25 mL) | Olympus plastics | 12-106 | |
| Serological pipets (50 mL) | Olympus plastics | 12-107 | |
| Ultrapure water (RNAse/DNAse free); nanopure water | Genessee Scientific | 18-194 | Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1 |
| Syringes (10 mL) | BD | 794412 | |
| Syringes (50 mL) | BD | 309653 | |
| 0.22 mm PES syringe filter | Olympus plastics | 25-244 | |
| PS cuvette semi-mico | Olympus plastics | 91-408 | |
| Software | |||
| Biorender | To prepare the figures | ||
| FacsDiva6.1.3 | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| Imaris | Bitplane | version 9.6 | |
| Zen Black | |||
| Equipment | |||
| FacsAriallu | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| LSM 880 confocal laser scanning microscope | Zeiss |
References
- Ramsay, K. A., et al. The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).
- Bessonova, L., et al. Data from the US and UK cystic fibrosis registries support disease modification by CFTR modulation with ivacaftor. Thorax. 73 (8), 731-740 (2018).
- Breuer, O., et al. Changing prevalence of lower airway infections in young children with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (5), 590-599 (2019).
- O’Donnell, J. N., Bidell, M. R., Lodise, T. P. Approach to the treatment of patients with serious multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa infections. Pharmacotherapy. 40 (9), 952-969 (2020).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).
- Darch, S. E., et al. Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4779-4784 (2018).
- Zhu, K., Chen, S., Sysoeva, T. A., You, L. Universal antibiotic tolerance arising from antibiotic-triggered accumulation of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Biology. 17 (12), 3000573 (2019).
- Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. Tolerance and resistance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to antimicrobial agents-how P. aeruginosa can escape antibiotics. Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).
- Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4110-4115 (2015).
- Darch, S. E., et al. Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model. MBio. 8 (2), 00240 (2017).
- Jorth, P., et al. Regional isolation drives bacterial diversification within cystic fibrosis lungs. Cell Host & Microbe. 18 (3), 307-319 (2015).
- Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
- Davies, D. G., et al. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science. 280 (5361), 295-298 (1998).
- Hartmann, R., et al. Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ. Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).
- Stacy, A., et al. Bacterial fight-and-flight responses enhance virulence in a polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7819-7824 (2014).
