एक स्यूडोमोनास एरुगिनोसा संक्रमण मॉडल के वास्तविक समय के आकलन के लिए उपकरण
Summary
सिंथेटिक सिस्टिक फाइब्रोसिस थूक माध्यम (SCFM2) दोनों confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी और फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है उच्च संकल्प पर जीवाणु समुच्चय का निरीक्षण करने के लिए । यह कागज विवरण भविष्य के अध्ययन के लिए एक मंच के रूप में रोगाणुरोधी उपचार के दौरान कुल आबादी का आकलन करने के लिए तरीकों ।
Abstract
स्यूडोमोनास एयरोगिनोसा (पीए) सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) से जुड़े सबसे आम अवसरवादी रोगजनकों में से एक है। एक बार पा उपनिवेशीकरण की स्थापना हो जाने के बाद, संक्रमित बैक्टीरिया का एक बड़ा हिस्सा वायुमार्ग थूक के भीतर बायोफिल्म बनाता है। सीएफ थूक से अलग पीए बायोफिल्म्स को ~ 10-1000 कोशिकाओं के छोटे, घने समुच्चय में विकसित करने के लिए दिखाया गया है जो स्थानिक रूप से संगठित हैं और रोगाणुरोधी सहिष्णुता जैसे चिकित्सकीय प्रासंगिक फेनोटाइप प्रदर्शित करते हैं। अध्ययन करने के लिए सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक कैसे Pa समुच्चय बदलते थूक पर्यावरण का जवाब पोषण प्रासंगिक और मजबूत प्रणाली है कि समग्र गठन को बढ़ावा देने की कमी है । एक सिंथेटिक CF थूक माध्यम (SCFM2) का उपयोग करना, पीए समुच्चय के जीवन इतिहास को एक ही सेल के संकल्प पर कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएफएम) और छवि विश्लेषण का उपयोग करके देखा जा सकता है। यह इन विट्रो सिस्टम वास्तविक समय, तीन आयामों और माइक्रोन पैमाने पर अलग-अलग आकार के हजारों समुच्चय के अवलोकन की अनुमति देता है। व्यक्तिगत और जनसंख्या के स्तर पर, फेनोटाइप और स्थिति द्वारा समूह समुच्चय की क्षमता होने से विभिन्न विकासात्मक चरणों में समुच्चय के अवलोकन और एंटीबायोटिक उपचार जैसे माइक्रोएनवायरमेंट में परिवर्तन के लिए उनकी प्रतिक्रिया को परिशुद्धता के साथ विभेदित करने की सुविधा प्रदान करता है।
Introduction
स्यूडोमोनास एयरोग्नोसा (पीए) एक अवसरवादी रोगजनक है जो प्रतिरक्षा-समझौता व्यक्तियों में पुराने संक्रमण स्थापित करता है। आनुवंशिक रोग सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) वाले लोगों के लिए, ये संक्रमण जीवन भर के पाठ्यक्रम का विस्तार कर सकते हैं। सीएफ वायुमार्ग में एक चिपचिपा, पोषक तत्वों से भरपूर थूक के निर्माण का कारण बनता है, जो समय के साथ विभिन्न प्रकार के माइक्रोबियल रोगजनकों द्वारा उपनिवेश बन जाता है। पीए सबसे प्रचलित CF रोगजनकों में से एक है, बचपन में वायुमार्ग उपनिवेश और मुश्किल से इलाज संक्रमण1 कीस्थापना । पीए एक महत्वपूर्ण नैदानिक समस्या बनी हुई है और हाल के वर्षों में बेहतर चिकित्सा आहार के बावजूद सीएफ के साथ उन लोगों में मृत्यु का एक प्रमुख कारण माना जाता है2,3। इस हठ फेनोटाइप और बढ़ती एंटीबायोटिक सहिष्णुता ने पी को रोगजनकों के एक समूह में एक जगह अर्जित की है, जो रोग नियंत्रण के लिए केंद्र (सीडीसी) और विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) द्वारा नई चिकित्सीय रणनीतियों के विकास के लिए अनुसंधान प्राथमिकताओं के रूप में पहचाने गए रोगजनकों के एक समूह में है-ESKAPE रोगजनक4 ।
अन्य ESKAPE रोगजनकों की तरह, अधिग्रहीतएंटीबायोटिक प्रतिरोध पीए में आम है, लेकिन कई आंतरिक गुण भी हैं जो पा एंटीमाइक्रोबियल सहिष्णुता में योगदान देते हैं। इनमें से पीए की ~ 10-1000 कोशिकाओं के समुच्चय-अत्यधिक घने समूह बनाने की क्षमता है, जिसे सीएफ रोगी थूक5,6सहित कई संक्रमणों में देखा जा सकता है। अन्य बायोफिल्म प्रणालियों में अध्ययन किए गए पीए के समान, पीए एंटीबायोटिक दवाओं के प्रतिरोध में वृद्धि और सेल-सेल संचार (कोरम संवेदन (क्यूएस) के सक्रियण जैसे चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक फेनोटाइप प्रदर्शित करता है। उदाहरण के लिए, पीए के समुच्चय को अन्य रोगाणुओं का मुकाबला करने के लिए क्यूएस-विनियमित व्यवहारों का उपयोग करने के साथ-साथ पाइओसाइनिन7के उत्पादन जैसे रोगाणुरोधी उपचारों को सहन करने के लिए दिखाया गया है। इस तरह के व्यवहार का अध्ययन करने की क्षमता एक वातावरण में जीवाणु पारिस्थितिकी प्रणालियों में एक रोमांचक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है जिसमें वे मानव शरीर में मौजूद हैं।
अध्ययन करने के लिए सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक कैसे Pa समुच्चय बदलते थूक पर्यावरण का जवाब पोषण प्रासंगिक और मजबूत प्रणाली है कि समग्र गठन को बढ़ावा देने की कमी है । पीए के बारे में जो कुछ जाना जाता है, उसमें विट्रो सिस्टम का उपयोग करके खोज की गई है जिसमें कोशिकाएं प्लैंकटॉनी या एक विशेषता सतह से जुड़ी होती हैं, “मशरूम” वास्तुकला जिसे वीवो8मेंनहीं देखा गया है। जबकि शास्त्रीय बायोफिल्म विकास मॉडल, जैसे प्रवाह कोशिकाओं या ठोस आगर, जीवाणु व्यवहार और एंटीबायोटिक सहिष्णुता के तंत्र के बारे में व्यापक और मूल्यवान ज्ञान मिले हैं, इन निष्कर्षों को हमेशा वीवो में अनुवाद नहीं करते हैं । कई इन विट्रो मॉडल में मानव संक्रमण स्थल के विकास के वातावरण की नकल करने की सीमित क्षमता होती है, जिससे वीवो अध्ययन में महंगा होना पड़ता है। बदले में, वीवो मॉडल में कई में इन विट्रो तकनीकों द्वारा प्रदान किए गए लचीलेपन और संकल्प की कमी है।
सिंथेटिक सिस्टिक फाइब्रोसिस थूक (SCFM2) सीएफ फेफड़ों में पुराने संक्रमण के दौरान अनुभवी के समान पीए विकास के लिए एक वातावरण प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। SCFM2 में म्यूसिन, लिपिड और डीएनए के अलावा उम्मीद सीएफ स्पुटा में पहचाने गए पोषण स्रोत शामिल हैं। SCFM2 में पीए वृद्धि के लिए वास्तविक थूक में वृद्धि के लिए आवश्यक एक समान जीन सेट की आवश्यकता होती है और यह प्राकृतिक पा कुलगठन 9,10का समर्थन करता है । टीका लगाने के बाद, प्लैंक्टोनिक कोशिकाएं समग्र रूप से बनती हैं जो विस्तार के माध्यम से आकार में वृद्धि करती हैं। व्यक्तिगत कोशिकाओं (प्रवासियों के रूप में संदर्भित) को एकत्रित से जारी किया जाता है, बिना कोलोनीकृत क्षेत्रों में स्थानांतरित किया जाता है, और नए समुच्चय10बनाते हैं। यह जीवन इतिहास एक एकल कोशिका के संकल्प पर सीएलएसएम और छवि विश्लेषण का उपयोग करके देखा जा सकता है। SCFM2 में गठित पीए के समुच्चय सीएफ फेफड़े10में देखे गए लोगों के समान आकार के होते हैं । यह मॉडल वास्तविक समय में और माइक्रोन पैमाने पर तीन आयामों में अलग-अलग आकार के कई समुच्चय के अवलोकन की अनुमति देता है। समय-चूक माइक्रोस्कोपी एक प्रयोग में हजारों (~ 50,000) समुच्चय की ट्रैकिंग की अनुमति देता है। छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग माइक्रोग्राफ से कुल फेनोटाइप के मात्राकरण की अनुमति देता है, जिसमें कुल मात्रा, सतह क्षेत्र, और तीन आयामों में स्थिति शामिल है, जो व्यक्तिगत कुल और जनसंख्या दोनों स्तरों पर निकटतम 0.1 माइक्रोन तक है। फेनोटाइप और स्थिति द्वारा समूह के लिए एकत्रित होने से विभिन्न विकासात्मक चरणों में सटीकता के साथ-साथ बदलते माइक्रोएनवायरमेंट6,11के प्रति उनकी प्रतिक्रिया के साथ-साथ एकत्रित होने की अनुमति देता है।
पीए का अध्ययन करने के लिए SCFM2 का आवेदन कम मात्रा में एकत्रित होता है और उच्च-थ्रूपुट परख इसे एक लचीला, लागत प्रभावी मॉडल बनाते हैं। एक परिभाषित माध्यम के रूप में, SCFM2 कई प्लेटफार्मों पर एकरूपता और प्रजनन क्षमता प्रदान करता है, जो विट्रो9में पीए समुच्चय का अध्ययन करने के लिए पोषण और शारीरिक रूप से प्रासंगिक विधि प्रदान करता है। अनुप्रयोगों में उच्च संकल्प पर स्थानिक संगठन और एंटीबायोटिक सहिष्णुता का निरीक्षण करने के लिए सीएलएम के साथ संयोजन में इसका उपयोग शामिल है (जैसा कि इस विधियों के कागज में वर्णित है)। वास्तविक समय, माइक्रोन-स्केल डेटा प्रदान करने वाले प्रयोगों को करने की क्षमता अंतर-प्रजातियों और अंतर-प्रजातियों की बातचीत के अध्ययन की अनुमति देती है क्योंकि वे वीवो मेंहो सकते हैं। उदाहरण के लिए, SCFM2 पहले पीए द्वारा उपयोग किए जाने वाले सिस्टम के नेटवर्क के माध्यम से कुल आबादी में सेल-सेल संचार की स्थानिक गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है ताकि कई जीनों को विनियमित किया जा सके जो उग्रता और रोगजनकता6में योगदान देते हैं।
चित्र 1:मुख्य प्रयोगात्मक चरणों का चित्रमय चित्रण। (ए)SCFM2 को पीए कोशिकाओं के साथ टीका लगाया जाता है और ग्लास-तली संस्कृति डिश में समुच्चय बनाने की अनुमति दी जाती है। (ख)एग्रीगेट्स को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में ट्रांसफर किया जाता है, और एंटीबायोटिक जोड़ा जाता है । चित्रित तीन तकनीकी प्रतिकृति (कक्षों 1-3) और एंटीबायोटिक उपचार के बिना टीका ति SCFM2 के एक नियंत्रण अच्छी तरह से (4) कर रहे हैं । 18 एच(सी)के दौरान सीएलएसएम का उपयोग करके समुच्चय को इमेज किया जाता है। 18-एच इमेजिंग के बाद, कुल 18 कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ इलाज किया जाता है और सीएलएसएम का उपयोग करके इमेज किया जाता है(डी)वांछित फेनोटाइप के साथ एकत्रित एससीएफएम 2 से वीएफएस का उपयोग करके अलग किया जाता है। संक्षिप्त: SCFM2 = सिंथेटिक सिस्टिक फाइब्रोसिस थूक माध्यम; Pa = स्यूडोमोनास एरुगिनोसा; CLSM = कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी; FACS = फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
यहां, वास्तविक समय में पीए समुच्चय पर एंटीबायोटिक उपचार के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए SCFM2 की उपयोगिता का प्रदर्शन किया जाता है, जिसके बाद डाउनस्ट्रीम विश्लेषण(चित्र 1)के लिए अलग-अलग फेनोटाइप के साथ समुच्चय की आबादी को अलग करने के लिए सेल-सॉर्टिंग दृष्टिकोण का उपयोग किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस काम ने ऐसे तरीके पेश किए हैं जिन्हें एंटीबायोटिक उपचार की उपस्थिति और अनुपस्थिति में बैक्टीरियल कुल आबादी का अध्ययन करने के लिए जोड़ा जा सकता है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन सीएलएसएम कुल बायोमास में परिवर्त…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एसईई डी को आणविक चिकित्सा विभाग, दक्षिण फ्लोरिडा विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान किए गए स्टार्ट-अप फंडों के साथ-साथ एक सीएफएफ रिसर्च ग्रांट (DARCH19G0) एनआईएच (5R21AI147654 – 02 (पीआई, चेन)) और माइक्रोबायोम पर यूएसएफ संस्थान द्वारा समर्थित किया जाता है। हम इस पांडुलिपि से संबंधित डेटा सेट से जुड़े चल रहे सहयोग के लिए Whiteley प्रयोगशाला का शुक्रिया अदा करते हैं । हम FACS छंटाई की सुविधा के लिए डॉ चार्ल्स Szekeres शुक्रिया अदा करते हैं । आंकड़े Biorender.com का उपयोग कर A.D.G.G और एसईई द्वारा बनाए गए थे ।
Materials
| Amino acids | |||
| Alanine | Acr s Organics |
56-41-7 | |
| Arginine HCl | MP | 1119-34-2 | |
| Asparagine | Acrs Organics |
56-84-8 | Prepared in 0.5 M NaOH |
| Cystine HCl | Alfa Aesar | L06328 | |
| Glutamic acid HCl | Acrs Organics |
138-15-8 | |
| Glycine | Acrs Organics |
56-40-6 | |
| Histidine HCl H2O | Alfa Aesar | A17627 | |
| Isoleucine | Acrs Organics |
73-32-5 | |
| Leucine | Alfa Aesar | A12311 | |
| Lysine HCl | Alfa Aesar | J62099 | |
| Methionine | Acrs Organics |
63-68-3 | |
| Ornithine HCl | Alfa Aesar | A12111 | |
| Phenylalanine | Acrs Organics |
63-91-2 | |
| Proline | Alfa Aesar | A10199 | |
| Serine | Alfa Aesar | A11179 | |
| Threonine | Acrs Organics |
72-19-5 | |
| Tryptophan | Acrs Organics |
73-22-3 | Prepared in 0.2 M NaOH |
| Tyrosine | Alfa Aesar | A11141 | Prepared in 1.0 M NaOH |
| Valine | Acrs Organics |
72-18-4 | |
| Antibiotic | |||
| Carbenicillin | Alfa Aesar | J6194903 | |
| Day-of Stocks | |||
| CaCl2 * 2H2O | Fisher Chemical | C79-500 | |
| Dextrose (D-glucose) | Fisher Chemical | 50-99-7 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Fisher (Avanti Polar Lipids) | 4235-95-4 | shake 15-20 min at 37 °C to evaporate chloroform |
| FeSO4 * 7H2O | Acrs Organics |
7782-63-0 | this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh |
| L-lactic acid | Alfa Aesar | L13242 | pH stock to 7 with NaOH |
| MgCl2 * 6H2O | Acrs Organics |
7791-18-6 | |
| N-acetylglucosamine | TCI | A0092 | |
| Prepared solids | |||
| Porcine mucin | Sigma | M1778-100G | UV-sterilize |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen | 15632-011 | |
| Stain | |||
| Propidium iodide | Alfa Aesar | J66764MC | |
| Salts | |||
| K2SO4 | Alfa Aesar | A13975 | |
| KCl | Alfa Aesar | J64189 | add solid directly to buffered base |
| KNO3 | Acrs Organics |
7757-79-1 | |
| MOPS | Alfa Aesar | A12914 | add solid directly to buffered base |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | add solid directly to buffered base |
| Na2HPO4 | RPI | S23100-500.0 | |
| NaH2PO4 | RPI | S23120-500.0 | |
| NH4Cl | Acrs Organics |
12125-02-9 | add solid directly to buffered base |
| Consumables | |||
| Conical tubes (15 mL) | Olympus plastics | 28-101 | |
| Conical tubes (50 mL) | Olympus plastics | 28-106 | |
| Culture tubes w/air flow cap | Olympus plastics | 21-129 | |
| 35 mm four chamber glass-bottom dish | CellVis | NC0600518 | |
| Luria Bertani (LB) broth | Genessee Scientific | 11-118 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Bioreagents | BP2944100 | |
| Pipet tips (p200) | Olympus plastics | 23-150RL | |
| Pipet tips (p1000) | Olympus plastics | 23-165RL | |
| Serological pipets (5 mL) | Olympus plastics | 12-102 | |
| Serological pipets (25 mL) | Olympus plastics | 12-106 | |
| Serological pipets (50 mL) | Olympus plastics | 12-107 | |
| Ultrapure water (RNAse/DNAse free); nanopure water | Genessee Scientific | 18-194 | Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1 |
| Syringes (10 mL) | BD | 794412 | |
| Syringes (50 mL) | BD | 309653 | |
| 0.22 mm PES syringe filter | Olympus plastics | 25-244 | |
| PS cuvette semi-mico | Olympus plastics | 91-408 | |
| Software | |||
| Biorender | To prepare the figures | ||
| FacsDiva6.1.3 | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| Imaris | Bitplane | version 9.6 | |
| Zen Black | |||
| Equipment | |||
| FacsAriallu | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| LSM 880 confocal laser scanning microscope | Zeiss |
References
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