Summary
Melanoom is een zeer agressieve ziekte die zich snel verspreidt naar andere organen. Dit protocol beschrijft de toepassing van ultra-hoogfrequente echografie, gekoppeld aan 3D-rendering, om het volume van de inguinale lymfeklieren in het Braf / Pten-muismodel van gemetastaseerd melanoom te bewaken.
Abstract
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox genetisch gemanipuleerde muizen (Braf/Pten muizen) worden veel gebruikt als in vivo model van gemetastaseerd melanoom. Zodra een primaire tumor is geïnduceerd door tamoxifenbehandeling, wordt een toename van de metastatische belasting waargenomen binnen 4-6 weken na inductie. Dit artikel laat zien hoe Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) beeldvorming kan worden gebruikt om de toename van gemetastaseerde betrokkenheid van de inguinale lymfeklieren te volgen door de toename van hun volume te meten.
Het UHFUS-systeem wordt gebruikt om verdoofde muizen te scannen met een lineaire UHFUS-sonde (22-55 MHz, axiale resolutie 40 μm). B-modus beelden van de inguinale lymfeklieren (zowel links als rechts) worden verkregen in een korte-asweergave, waarbij de dieren in dorsale lighouding worden geplaatst. Echografierecords worden verkregen met behulp van een stapgrootte van 44 μm op een gemotoriseerde mechanische arm. Daarna worden tweedimensionale (2D) B-modus acquisities geïmporteerd in het softwareplatform voor ultrasone beeldnabewerking en worden inguinale lymfeklieren semi-automatisch geïdentificeerd en gesegmenteerd in de verkregen cross-sectionele 2D-beelden. Ten slotte wordt automatisch een totale reconstructie van het driedimensionale (3D) volume verkregen, samen met de weergave van het lymfekliervolume, dat ook wordt uitgedrukt als een absolute meting.
Deze niet-invasieve in vivo techniek wordt zeer goed verdragen en maakt het mogelijk om meerdere beeldvormingssessies op hetzelfde proefdier gedurende 2 weken te plannen. Het is daarom ideaal om de impact van farmacologische behandeling op gemetastaseerde ziekte te beoordelen.
Introduction
Melanoom is een agressieve vorm van huidkanker die zich vaak verspreidt naar andere huidplaatsen (subcutane metastasen), evenals naar lymfeklieren, longen, lever, hersenen en botten1. In het afgelopen decennium zijn nieuwe geneesmiddelen geïntroduceerd in de klinische praktijk en hebben ze bijgedragen aan het verbeteren van de levensverwachting van patiënten met gemetastaseerd melanoom. Er blijven echter beperkingen bestaan, waaronder variabele tijd tot en mate van respons, ernstige bijwerkingen en de toename van verworven resistentie1. Daarom is het cruciaal om gemetastaseerde verspreiding in een vroeg stadium te detecteren, d.w.z. wanneer het de lokale lymfeklieren bereikt.
Een biopsie van de lokale lymfeklieren (schildwachtklieren) wordt meestal uitgevoerd om te controleren op de aanwezigheid van melanoomcellen. Echografie grijpt echter aan als een niet-invasieve methode om metastatische betrokkenheid te detecteren, omdat het beter presteert dan klinische evaluatie en een onnodige biopsie kan helpen voorkomen2,3,4. Bovendien lijkt echografie geschikt voor lymfekliersurveillance, vooral in het geval van gevorderde leeftijd en/of comorbiditeiten5,6. De kenmerken die worden gedetecteerd door ultrasone analyse en die het onderscheid tussen normale en gemetastaseerde lymfeklieren mogelijk maken, omvatten verhoogde grootte (volume), verandering van vorm van ovaal naar rond, onregelmatige marge, veranderd echogeen patroon en veranderde (verhoogde) vascularisatie7.
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox genetisch gemanipuleerde muizen (Braf/Pten muizen) zijn onlangs beschikbaar gesteld aan de wetenschappelijke gemeenschap als een weefselspecifiek en induceerbaar model voor gemetastaseerd melanoom8. In dit diermodel ontwikkelen primaire tumoren zich zeer snel: ze worden zichtbaar binnen 2-3 weken na de inductie van de overgang van wild-type (wt) Braf naar BrafV600E en van het verlies van Pten, terwijl ze binnen 4 weken een volume van 50-100 mm3 bereiken. In de volgende 2 weken gaat de groei van de primaire tumor gepaard met een progressieve toename van de metastatische belasting op andere huidplaatsen, lymfeklieren en longen.
Braf/Pten-muizen zijn op grote schaal gebruikt voor meerdere doeleinden, waaronder de dissectie van signaalroutes die betrokken zijn bij melanoomgenese9,10, de identificatie van melanoomcellen van oorsprong11,12,13, en het testen van nieuwe therapeutische opties in termen van zowel gerichte therapie als immunotherapie8,14,15,16 . Specifiek gebruikten we Braf / Pten-muizen om aan te tonen dat verzwakte Listeria monocytogenes (Lmat) werkt als een anti-melanoomvaccin. Wanneer systemisch toegediend in de therapeutische setting, is Lmat niet geassocieerd met algehele toxiciteit omdat het zich selectief ophoopt op tumorplaatsen. Bovendien veroorzaakt het een opmerkelijke afname van de primaire melanoommassa en een vermindering van de metastatische belasting in de lymfeklieren en longen. Op moleculair niveau veroorzaakt Lmat apoptotische doding van melanoomcellen, wat ten minste gedeeltelijk te wijten is aan niet-celauto autonome activiteiten (rekrutering ter plaatse van CD4+ en CD8+ T-lymfocyten)16.
Wanneer Braf /Pten-muizen worden gebruikt voor melanoommodellering, kan de groei van primaire tumoren en subcutane metastasen worden gevolgd door remklauwmetingen. De betrokkenheid van lymfeklieren en longen moet echter worden onderzocht met behulp van een alternatieve techniek, mogelijk een niet-invasieve techniek waarmee onderzoekers hetzelfde dier in de loop van de tijd kunnen volgen. Dit artikel beschrijft het gebruik van echografie (figuur 1), gekoppeld aan een daaropvolgende 3D-volumetrische analyse van de verkregen gegevens, voor de longitudinale monitoring van de toename in grootte (volume) van inguinale lymfeklieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid (dierprotocollen #754/2015-PR en #684/2018-PR).
1. Melanoom inductie
OPMERKING: Zes weken oude Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox muizen [B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)] werden gebruikt in deze studie (zie de Tabel met Materialen).
- Behandel de muizen met 4-hydroxytamoxifen (4-HT) door 3 μL van 5 mM 4-HT aan te brengen op ~ 1 cm2 geschoren huid van de bovenrug, zoals eerder beschreven11,16,17, gedurende 3 dagen achter elkaar.
OPMERKING: Dit activeert het Cre-enzym en veroorzaakt een overstap van wt Braf naar BrafV600E en het verlies van Pten. Deze twee treffers zijn voldoende om melanoomvorming te induceren. - Merk op dat primaire tumoren zich ontwikkelen op de plaats van de huidverf in 2-3 weken en een volume van 50-100 mm3 bereiken in 4 weken. Observeer ook metastasen naar andere huidplaatsen, lymfeklieren en longen op dit tijdstip (t0).
- Gebruik remklauwen om het volume van de primaire tumor en van subcutane metastasen te meten, en echografie om het volume van de inguinale lymfeklieren te meten. Herhaal deze metingen na een week (t1, 5 weken na het schilderen van de huid) en na twee weken (t2, 6 weken na het schilderen van de huid).
- Op het laatste moment euthanaseer je de muizen door een overdosis gasvormig sevoraan te nemen.
- Analyseer de primaire tumor en lymfeklieren door visuele inspectie en snijd ze vervolgens weg voor histologische studies, zoals gerapporteerd in16.
2. Beeldvormingsprocedure
- Plaats de muis in een inductiekamer voor gasanesthesie en lever 3% isofluraan in zuivere zuurstof totdat het dier volledig is verdoofd. Controleer de diepte van de anesthesie door gebrek aan respons op pootknijpen.
- Breng het dier over naar een verwarmde plank - een constitutief deel van het UHFUS-beeldvormingsstation - met het dier in rugligging. Gebruik een rectale sonde gesmeerd met vaseline om de lichaamstemperatuur te meten. Pas de boardtemperatuur aan om de lichaamstemperatuur van de muis binnen het fysiologische bereik (36 ± 1°C) te houden.
- Bevochtig de ogen van de muis met dierenartszalf om droogheid tijdens de anesthesie te voorkomen. Voer verdovend gas (1,5% isofluraan in zuivere zuurstof) in via het neusmasker van een muis. Pas het percentage isofluraan aan om de juiste diepte van de anesthesie te behouden.
- Bekleed de voor- en achterpoten met geleidende pasta en plak ze op de ECG-plaatelektroden die in het bord zijn ingebed. Controleer of de fysiologische parameters (hartslag, ademhalingssignaal en kerntemperatuur van het lichaam) correct zijn verkregen en weergegeven.
- Verwijder het haar van beide inguinale gebieden door een ontharingsmiddel aan te brengen en bedek ze met een akoestisch koppelingsmedium.
- Klem de lineaire UHFUS-sonde (40 MHz middenfrequentie) in een gespecialiseerde 3D-motor die is ingebed in het UHFUS-beeldvormingsstation, waardoor geautomatiseerde en stapsgewijze beweging van de sonde mogelijk is.
- Oriënteer en pas de positie van de ultrasone sonde goed aan om beelden met een korte as van de inguinale lymfeklier (links / rechts) te verkrijgen en plaats het interessegebied in de focuszone.
- Scan het volledige volume van de inguinale lymfeklier als een reeks 2D B-modusbeelden, zoals eerder beschreven18. Verkrijg beelden op meerdere niveaus van de lymfeklier door lineaire beweging van de transducer met stapgroottes op micrometerschaal, om 3D-gegevens te genereren in termen van automatisch ademhalings- en cardiale cinelussen.
- Stel de beeldopname in met de volgende parameters: scanafstand variërend tussen 2 en 5 mm (afhankelijk van de grootte van de lymfeklier); stapgrootte 44 μm, met een uitkomst van 46-114 scanstappen/lymfeklierplakken en een acquisitietijd van 1-3 min per dier. Sla de verkregen beelden digitaal op in raw-formaat (DICOM) voor verdere offline analyses.
- Stop aan het einde van de beeldvormingssessie met de gasanesthesie en laat het dier herstellen op de verwarmingsplank in sternale lighouding. Zorg voor het dier totdat het voldoende bij bewustzijn is gekomen om de buikligging te behouden.
3. Nabewerking van echobeelden
- Open de dataset van DICOM 3D-beelden van de linker/rechter inguinale lymfeklier in het softwareplatform voor echografische beeldnabewerking.
- Segmentatie:
- Selecteer Multi-slice-methode om zowel de huidige frames als de miniaturen van alle frames te visualiseren die overeenkomen met elke afbeelding die is vastgelegd tijdens de 3D-acquisitie.
- Selecteer de miniatuur van het eerste frame om het in de contourweergave te laden. Klik in de contourweergave met de linkermuisknop om punten langs de rand van de lymfeklier te laten vallen. Zodra het gewenste aantal punten is ingesteld (bereik 10-15), klikt u met de rechtermuisknop om de contour te voltooien.
- Nadat de eerste contour is voltooid, gebruikt u de miniatuurweergave om de volgende afbeelding voor contouren te selecteren. Sla indien nodig meerdere afbeeldingen (gemiddeld 3 frames) over tussen contouren om het aantal handmatige sporen dat nodig is voor elk 3D-volume te verminderen.
OPMERKING: Het softwareplatform voor de nabewerking van echografiebeelden genereert automatisch contouren tussen handmatige sporen, waardoor de analysetijd wordt verkort. - Herhaal dit proces totdat het volledige volume is aangegeven. Als u klaar bent, klikt u op Voltooien.
- Generatie van het 3D wireframe en volumemeting:
- Klik in de werkruimte van het 3D-modusvenster op het pictogram Volumemeting onder het afbeeldingsweergavegebied om de oppervlakteweergave te activeren.
OPMERKING: De oppervlakteweergave maakt een compilatieweergave die het door de gebruiker gegenereerde volume toewijst aan de verkregen afbeelding. Het oppervlaktebeeld kan in elke gewenste positie worden gedraaid. - Noteer de volumemeting in de linkerbenedenhoek van de kubusweergave.
OPMERKING: Segmentatie en 3D-volumegeneratie kunnen ook worden verkregen met behulp van op maat ontwikkelde software en /of vrij beschikbare / commerciële software voor algemene beeldverwerking. Uitgaande van handmatige segmentatie moet de software een wiskundige en/of pixelniveau beschrijving geven van de lymfekliercontouren. Deze contouren zouden worden gecombineerd in een 3D-ruimte om het buitenoppervlak van lymfeklieren weer te geven. Alle stappen beschreven in de beeldvormingsprocedure en de nabewerking van echografiebeelden zijn samengevat in figuur 2.
- Klik in de werkruimte van het 3D-modusvenster op het pictogram Volumemeting onder het afbeeldingsweergavegebied om de oppervlakteweergave te activeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na het schilderen van de huid van Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox muizen met 4-HT, wordt Cre activiteit geïnduceerd, waardoor er een schakelaar is op het genomische niveau van wt Braf naar BrafV600E, terwijl Pten verloren gaat (Figuur 3A). In 2-3 weken ontwikkelen muizen ter plaatse primaire tumoren met 100% penetrantie. Na vier weken na 4-HT-behandeling (t0) bereiken primaire tumoren een volume van 50-100 mm3 en kan hun groei nog eens 2 weken worden gemeten door remklauwen ((t1 en t2; Figuur 3B, bovenste panelen). Latere tijdstippen kunnen niet worden bereikt omdat de tumor zo groot wordt dat de muizen euthanasie nodig hebben.
Wat de gemetastaseerde belasting betreft, wordt een geleidelijke toename van pigmentatie waargenomen in de inguinale lymfeklieren binnen 4-6 weken na 4-HT-behandeling (figuur 3B, onderste panelen). Een dergelijke toename van pigmentatie is te wijten aan de aanwezigheid van melanineafzettingen, zoals kan worden bevestigd door hematoxyline- en eosinekleuring uitgevoerd zonder de melanine te verwijderen. Op hun beurt zijn de melanineafzettingen steevast te wijten aan de aanwezigheid van uitgezaaide melanoomcellen, zoals bevestigd door immunohistochemische (IHC) kleuring van het melanoomantigeen MLANA en van BRAFV600E (figuur 3C).
De accumulatie van gepigmenteerde melanoomcellen in inguinale lymfeklieren gaat gepaard met een progressieve toename van hun volume, zoals blijkt uit visuele inspectie (figuur 3B, onderste panelen). Echografie biedt de unieke mogelijkheid om een dergelijke toename longitudinaal te kwantificeren, in elke experimentele muis, zoals eerder beschreven16. Volumetrische metingen, segmentatieresultaten en 3D-rendering, allemaal verwijzend naar een representatief geval, worden weergegeven in figuur 4. Het volume van elke lymfeklier wordt verkregen door handmatige segmentatie van de axiale secties die tijdens een 3D-scan zijn verkregen.
Aan het einde van de segmentatiefase tonen alle secties de overlay van de externe contour van de lymfeklier (figuur 4A). Deze contouren worden frame voor frame verbonden in de renderingfase en het buitenoppervlak van de hele lymfeklier wordt in de 3D-ruimte geprojecteerd. Als representatief voorbeeld wordt de 3D-weergave van een rechter inguinale lymfeklier geanalyseerd op t0, t1 en t2 weergegeven in respectievelijk figuur 4B, figuur 4C en figuur 4D. De grafiek in figuur 4E kwantificeert de toename van het volume die de linker en rechter inguinale lymfeklieren van hetzelfde dier in de loop van de tijd vertonen.
Figuur 1: Het echografiesysteem dat wordt gebruikt om de toename van het volume van de inguinale lymfeklieren in het Braf/Pten genetisch gemanipuleerde muismodel van melanoom te volgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Stapsgewijze samenvatting van de beeldvormingsprocedure en de nabewerking van echografiebeelden. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.
Figuur 3: Visuele inspectie en histologische analyses van inguinale lymfeklieren in het weefselspecifieke en induceerbare Braf/Pten gemetastaseerd melanoommodel bij de muis. (A) Cre-enzym veroorzaakt de omschakeling van wt Braf in BrafV600E en het verlies van Pten (excisie van exonen 4 en 5). Dit systeem is melanocyt-specifiek omdat de expressie van het Cre-enzym onder controle staat van de promotor van tyrosinase, een enzym dat betrokken is bij de melaninesynthese. Daarom zijn de twee oncogene hits beperkt tot de melanocytische afstamming. Dit systeem is ook induceerbaar omdat Cre wordt uitgedrukt als een fusie-eiwit met de oestrogeenreceptor en vereist dat huidverf met 4-HT wordt getransloceerd naar de kern, waar het zijn functie kan uitoefenen. (B) Het verschijnen van primaire melanoomtumoren (bovenste foto's) en inguinale lymfeklieren (onderste foto's) na 4, 5 en 6 weken na 4-HT-behandeling (respectievelijk t0, t1 en t2). In lymfeklieren wordt de toename van melanineaccumulatie en -grootte gedetecteerd door visuele inspectie. Schaalbalken = 0,5 cm (bovenste afbeeldingen); 0.2 cm (onderste foto's). (C) Histologische analyses van inguinale lymfeklieren, 6 weken na 4-HT behandeling. (linksboven) H&E-kleuring: melanineafzettingen worden verwijderd door plakjes te incuberen met 1% KOH en 3% H2O2. (rechtsboven) Melaninedetectie uitgevoerd door H&E-kleuring zonder 1% KOH- en 3% H2O2-behandeling. (linksonder) MLANA detectie door immunoperoxidase kleuring (DAB chromogeen substraat en hematoxyline counterstaining). (rechtsonder) BRAFV600E detectie door immunoperoxidasekleuring (DAB-chromogeensubstraat en hematoxyline-counterstaining). Voor alle panelen, originele vergroting: 40x; schaalstaven = 20 μm. Afkortingen: wks = weken; wt = wild-type; 4-HT = 4-hydroxytamoxifen; H&E = hematoxyline en eosine; DAB = 3,3'-diaminobenzidine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Metingen, segmentatie en 3D-weergave van het volume van de inguinale lymfeklieren in het weefselspecifieke en induceerbare Braf/Pten gemetastaseerd melanoommodel in de muis. (A) Overlay van de externe contouren van de rechter liesklier in 4 representatieve gescande secties verkregen door handmatige segmentatie. (B-D) Weergave van het 3D-volume van de rechter liesklier, zoals gemeten op 4, 5 en 6 weken na 4-HT-behandeling (respectievelijk t0-, t1- en t2-tijdstippen). De numerieke waarde van het volume wordt ook gerapporteerd (in mm3). (E) Het volume van de linker (zwarte cirkel) en de rechter (witte cirkel) inguinale lymfeklier van hetzelfde dier op t0, t1 en t2 tijdstippen. Afkortingen: 3D = driedimensionaal; 4-HT = 4-hydroxytamoxifen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De gegevens verkregen in deze studie bevestigen het vermogen van echografie om de metastatische betrokkenheid van inguinale lymfeklieren van het Braf / Pten-muismodel van gemetastaseerd melanoom te controleren. Zoals eerder aangetoond16, is deze techniek vooral nuttig om de werkzaamheid van medicamenteuze behandeling te beoordelen. Dit komt omdat het de monitoring van de verandering in lymfekliervolume in hetzelfde dier in de loop van de tijd mogelijk maakt, door de metingen verzameld bij t1 en t2 te vergelijken met die verzameld bij t0. Dit draagt op zijn beurt bij aan een toename van de robuustheid van de verkregen resultaten, omdat intermuisvariabiliteit en andere factoren die de grootte van de basale lymfeklieren kunnen beïnvloeden, allemaal worden verantwoord. Bovendien maakt echografie naleving van het 3R-principe mogelijk door het aantal dieren per experimentele groep te verminderen.
Bij Braf / Pten-muizen zijn niet alleen inguinale, maar ook brachiale en axillaire lymfeklieren plaatsen van metastatische verspreiding. Het is echter raadzaam om zich te concentreren op inguinale lymfeklieren omdat de anderen te dicht bij de primaire tumorplaats liggen, wat meestal hun lokalisatie en morfologie verandert tijdens de ontwikkeling van de primaire tumor zelf. Als alternatief kunnen brachiale en oksellymfeklieren geschikt worden voor echografie als een andere plaats van tumorinductie wordt gekozen, zoals oren of poten8. Wat andere gemetastaseerde plaatsen betreft, kunnen longen niet worden bestudeerd met behulp van echografie, vanwege de aanwezigheid van lucht in het weefsel. Theoretisch konden met deze techniek alleen oppervlakkige pulmonale metastasen die de pleurale interface bereikten, worden gevisualiseerd. Hoewel microcomputertomografie / positronemissietomografie (CT / PET) in plaats daarvan kan worden gebruikt, heeft deze aanpak verschillende nadelen, waaronder hoge kosten en beperkte beschikbaarheid. Bovendien is micro CT/PET, gebaseerd op ioniserende straling, nauwelijks compatibel met longitudinale metingen op meerdere tijdstippen. Omgekeerd kan echografie eenvoudig worden toegepast op de studie van subcutane metastasen en maakt het de meting van zowel volume als vascularisatie mogelijk16.
Als een tijdsbestek van 2 weken te kort is om de effecten van het onderzochte geneesmiddel te waarderen, kan een meer perifere inductieplaats (bijv. de punt van de staart9,11) of een minder tumorgevoelig genotype (Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/+-muizen in plaats van Tyr::CreER+, BrafCA/+, Ptenlox/lox-muizen) worden geselecteerd9 . In beide gevallen zal de groei van de primaire tumor naar verwachting veel langzamer zijn, waardoor metastasemonitoring tot veel meer dan 6 weken na inductie met 4-HT mogelijk is.
Vanuit een meer technisch oogpunt is het belangrijk op te merken dat 2D-segmentatie van ultrasone beelden de meest kritieke stap in dit protocol is, omdat dit de meting van 3D-volume kan beïnvloeden. Gelukkig is in het Braf/Pten diermodel het contrast tussen lymfeklieren en omliggende weefsels vrij groot, zodat het uittekenen van de lymfeklierranden door handmatige segmentatie relatief eenvoudig is. Het segmentatieproces moet echter worden vergemakkelijkt door de hoge kwaliteit van de echografiebeelden die door de echoscopist zijn verkregen, die op zijn beurt zeer ervaren en gericht moet zijn op het verkrijgen van dezelfde ultrasone projectie van de lymfeklier, zelfs in scansessies die op verschillende tijdstippen worden uitgevoerd.
B-modus echografie beeldvorming kan kankercellen niet direct markeren; in plaats daarvan maakt het de gevolgtrekking van hun aanwezigheid mogelijk uit de toename van het volume van inguinale lymfeklieren. In het licht van deze informatie wordt aanbevolen om echografie te koppelen aan de juiste IHC-kleuring van de lymfeklieren, zodat de aanwezigheid van kankercellen op moleculair niveau kan worden bevestigd. Een lymfekliervergroting waargenomen in een geïnduceerde Braf / Pten-muis is echter meestal toe te schrijven aan de verspreiding van kanker en niet aan een andere oorzaak, bijvoorbeeld een voortdurende infectie. Dit komt waarschijnlijk omdat experimentele muizen die worden gebruikt voor echografie worden gefokt in gecontroleerde omstandigheden en routinematig worden onderworpen aan sanitaire screening, zodat ziekte onmiddellijk wordt opgemerkt en behandeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen S. Burchielli (FTGM, Pisa) bedanken voor haar hulp bij dierprocedures. Dit werk werd ondersteund door ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica institutionele financiering van LP; MFAG #17095 toegekend door AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro aan LP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxytamoxifen | Merck | H6278 | drug used for tumor induction |
| B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice | The Jackson Laboratory | 013590 | |
| Blu gel | Sooft Ialia | ophthalmic solution gel | |
| BRAFV600E antibody | Spring Bioscience Corporation | E19290 | |
| IsoFlo (isoflorane) | Zoetis | liquid for gaseous anaesthesia | |
| MLANA antibody | Thermo Fisher Scientific | M2-7C10 | |
| Sigma gel | Parker | electrode gel | |
| Transonic gel clear | Telic SAU | ultrasound gel | |
| Veet | Reckitt Benckiser IT | depilatory cream | |
| Compact Dual Anesthesia System | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber | |
| MX550S | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS linear probe | |
| Vevo 3100 | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS system | |
| Vevo Imaging Station | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board | |
| Vevo Lab | Fujifilm, Visualsonics Inc. | software platform for ultrasound image post-processing |
References
- Schvartsman, G., et al. Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663 (2019).
- Blum, A., et al. Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma - Results of a prospective study of 1288 patients. Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).
- Olmedo, D., et al. Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis. Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).
- Voit, C., et al. Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma. Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).
- Hayes, A. J., et al. Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma. British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).
- Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients. Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).
- Jayapal, N., et al. Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, Suppl 2 338-346 (2019).
- Dankort, D., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
- Damsky, W. E., et al. β-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas. Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).
- Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma. Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).
- Kohler, C., et al. Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes. Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).
- Yuan, P., et al. Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).
- Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).
- Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma. American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).
- Steinberg, S. M., et al. BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma. Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).
- Vitiello, M., et al. Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma. Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).
- Moon, H., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma. Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).
