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Cancer Research

Análisis del volumen de los ganglios linfáticos mediante imágenes de ultrasonido de frecuencia ultra alta en el modelo de melanoma de ratón genéticamente modificado braf/pten

Published: September 8, 2021 doi: 10.3791/62527
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,2
1Institute of Clinical Physiology, National Research Council (IFC-CNR), 2Oncogenomics Unit, Core Research Laboratory, ISPRO

Summary

El melanoma es una enfermedad muy agresiva que se propaga rápidamente a otros órganos. Este protocolo describe la aplicación de imágenes de ultrasonido de frecuencia ultra alta, junto con la representación 3D, para monitorear el volumen de los ganglios linfáticos inguinales en el modelo de ratón Braf / Pten de melanoma metastásico.

Abstract

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox ratones genéticamente modificados (ratones Braf/Pten) son ampliamente utilizados como modelo in vivo de melanoma metastásico. Una vez que un tumor primario ha sido inducido por el tratamiento con tamoxifeno, se observa un aumento en la carga metastásica dentro de las 4-6 semanas posteriores a la inducción. Este artículo muestra cómo las imágenes de Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) pueden ser explotadas para monitorear el aumento en la afectación metastásica de los ganglios linfáticos inguinales midiendo el aumento en su volumen.

El sistema UHFUS se utiliza para escanear ratones anestesiados con una sonda lineal UHFUS (22-55 MHz, resolución axial 40 μm). Las imágenes en modo B de los ganglios linfáticos inguinales (tanto del lado izquierdo como del derecho) se adquieren en una vista de eje corto, posicionando a los animales en reclinación dorsal. Los registros de ultrasonido se adquieren utilizando un tamaño de paso de 44 μm en un brazo mecánico motorizado. Posteriormente, las adquisiciones bidimensionales (2D) en modo B se importan a la plataforma de software para el posprocesamiento de imágenes de ultrasonido, y los ganglios linfáticos inguinales se identifican y segmentan de forma semiautomática en las imágenes 2D transversales adquiridas. Finalmente, se obtiene automáticamente una reconstrucción total del volumen tridimensional (3D) junto con la representación del volumen de los ganglios linfáticos, que también se expresa como una medición absoluta.

Esta técnica in vivo no invasiva es muy bien tolerada y permite la programación de múltiples sesiones de imagen en el mismo animal experimental durante 2 semanas. Por lo tanto, es ideal evaluar el impacto del tratamiento farmacológico en la enfermedad metastásica.

Introduction

El melanoma es una forma agresiva de cáncer de piel que a menudo se disemina a otros sitios de la piel (metástasis subcutáneas), así como a los ganglios linfáticos, los pulmones, el hígado, el cerebro y los huesos1. En la última década, se han introducido nuevos fármacos en la práctica clínica y han contribuido a mejorar la esperanza de vida de los pacientes con melanoma metastásico. Sin embargo, persisten limitaciones, incluyendo el tiempo variable y el grado de respuesta, los efectos secundarios graves y la insurgencia de la resistencia adquirida1. Por lo tanto, es crucial detectar la propagación metastásica en sus primeras etapas, es decir, cuando llega a los ganglios linfáticos locales.

Por lo general, se realiza una biopsia de los ganglios linfáticos locales (ganglios linfáticos centinela) para verificar la presencia de células de melanoma. Sin embargo, la ecografía se está afianzando como un método no invasivo para detectar la afectación metastásica, ya que supera la evaluación clínica y puede ayudar a evitar una biopsia innecesaria2,3,4. Además, la ecografía parece apropiada para la vigilancia de los ganglios linfáticos, especialmente en el caso de edad avanzada y/o comorbilidades5,6. Las características que se detectan mediante ecografía y permiten la diferenciación entre ganglios linfáticos normales y metastásicos comprenden aumento de tamaño (volumen), cambio de forma de ovalado a redondo, margen irregular, patrón ecogénico alterado y vascularización alterada (aumentada)7.

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox ratones genéticamente modificados (ratones Braf/Pten) se han puesto recientemente a disposición de la comunidad científica como un modelo tisular específico e inducible para el melanoma metastásico8. En este modelo animal, los tumores primarios se desarrollan muy rápidamente: se hacen visibles dentro de las 2-3 semanas posteriores a la inducción del cambio de Braf de tipo salvaje (wt) a BrafV600E y de la pérdida de Pten, mientras que alcanzan un volumen de 50-100 mm3 en 4 semanas. En las siguientes 2 semanas, el crecimiento del tumor primario se acompaña de un aumento progresivo de la carga metastásica en otros sitios de la piel, ganglios linfáticos y pulmones.

Los ratones Braf/Pten han sido ampliamente utilizados para múltiples propósitos, incluyendo la disección de vías de señalización implicadas en la melanomagénesis9,10, la identificación de células de melanoma de origen11,12,13 y la prueba de nuevas opciones terapéuticas tanto en términos de terapia dirigida como de inmunoterapia8,14,15,16 . Específicamente, utilizamos ratones Braf / Pten para demostrar que Listeria monocytogenes atenuada (Lmat) funciona como una vacuna contra el melanoma. Cuando se administra sistémicamente en el entorno terapéutico, Lmat no se asocia con toxicidad general, ya que se acumula selectivamente en los sitios tumorales. Además, causa una disminución notable en la masa de melanoma primario y una reducción en la carga metastásica en los ganglios linfáticos y los pulmones. A nivel molecular, Lmat provoca la muerte apoptótica de las células de melanoma, que se debe, al menos en parte, a actividades no autónomas celulares (reclutamiento in situ de linfocitos T CD4+ y CD8+)16.

Cuando se utilizan ratones Braf/Pten para el modelado de melanoma, el crecimiento de tumores primarios y metástasis subcutáneas se puede monitorear mediante mediciones de calibradores. Sin embargo, la afectación de los ganglios linfáticos y los pulmones debe investigarse utilizando una técnica alternativa, posiblemente una no invasiva que permita a los investigadores seguir al mismo animal a lo largo del tiempo. En este trabajo se describe el uso de la ecografía (Figura 1), junto con un posterior análisis volumétrico 3D de los datos obtenidos, para la monitorización longitudinal del aumento de tamaño (volumen) de los ganglios linfáticos inguinales.

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Protocol

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Ministerio de Salud italiano (protocolos animales #754/2015-PR y #684/2018-PR).

1. Inducción del melanoma

NOTA: En este estudio se utilizaron ratones Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox [B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)] (ver la Tabla de Materiales).

  1. Tratar a los ratones con 4-hidroxitamoxifeno (4-HT) aplicando 3 μL de 5 mM 4-HT sobre ~1 cm2 de piel afeitada de la parte superior de la espalda, como se describió anteriormente11,16,17, durante 3 días seguidos.
    NOTA: Esto activará la enzima Cre y causará un cambio de wt Braf a BrafV600E y la pérdida de Pten. Estos dos golpes son suficientes para inducir la formación de melanoma.
  2. Observe que los tumores primarios se desarrollan en el sitio de la pintura de la piel en 2-3 semanas y alcanzan un volumen de 50-100 mm3 en 4 semanas. Además, observe metástasis en otros sitios de la piel, ganglios linfáticos y pulmones en este punto de tiempo (t0).
  3. Use pinzas para medir el volumen del tumor primario y de las metástasis subcutáneas, y ecografías para medir el volumen de los ganglios linfáticos inguinales. Repita estas mediciones después de una semana (t1, 5 semanas después de la pintura de la piel) y después de dos semanas (t2, 6 semanas después de la pintura de la piel).
  4. En el último punto de tiempo, eutanasia a los ratones por sobredosis con sevorano gaseoso.
  5. Analizar el tumor primario y los ganglios linfáticos mediante inspección visual, luego extirparlos para estudios histológicos, como se informó en16.

2. Procedimiento de obtención de imágenes

  1. Coloque el ratón en una cámara de inducción para anestesia con gas y suministre un 3% de isoflurano en oxígeno puro hasta que el animal esté completamente anestesiado. Verifique la profundidad de la anestesia por falta de respuesta al pellizco de la pata.
  2. Transfiera el animal a una tabla calentada, una parte constitutiva de la estación de imágenes UHFUS, que lo mantiene en posición supina. Use una sonda rectal lubricada con vaselina para medir la temperatura corporal. Ajuste la temperatura de la placa para mantener la temperatura corporal del ratón en el rango fisiológico (36 ± 1 ° C).
  3. Humedezca los ojos del ratón con ungüento veterinario para prevenir la sequedad durante la anestesia. Suministrar gas narcótico (1,5% de isoflurano en oxígeno puro) a través de la máscara nasal de un ratón. Ajuste el porcentaje de isoflurano para mantener la profundidad correcta de la anestesia.
  4. Cubra las patas delanteras y traseras con pasta conductora y péguelas con cinta adhesiva a los electrodos de la placa de ECG incrustados en la placa. Compruebe que los parámetros fisiológicos (frecuencia cardíaca, señal de respiración y temperatura corporal central) se adquieran y muestren correctamente.
  5. Eliminar el vello de ambas zonas inguinales aplicando un agente depilatorio y recubrirlas con un medio de acoplamiento acústico.
  6. Sujete la sonda lineal UHFUS (frecuencia central de 40 MHz) en un motor 3D especializado integrado en la estación de imágenes UHFUS, lo que permite el movimiento automatizado y paso a paso de la sonda.
  7. Orientar y ajustar adecuadamente la posición de la sonda de ultrasonido para obtener imágenes de eje corto del ganglio linfático inguinal (izquierda/derecha), y colocar la región de interés en la zona focal.
  8. Escanear todo el volumen del ganglio linfático inguinal como una secuencia de imágenes 2D en modo B, como se describió anteriormente18. Adquiera imágenes en múltiples niveles del ganglio linfático mediante el movimiento lineal del transductor con tamaños de paso a escala micrométrica, para generar datos 3D en términos de bucles de cine activados automáticamente por respiración y corazón.
  9. Configure la grabación de la imagen con los siguientes parámetros: distancia de escaneo que oscila entre 2 y 5 mm (dependiendo del tamaño de los ganglios linfáticos); tamaño del escalón 44 μm, con un resultado de 46-114 pasos de exploración/cortes de ganglios linfáticos y un tiempo de adquisición de 1-3 min por animal. Almacene digitalmente las imágenes adquiridas en formato RAW (DICOM) para realizar más análisis fuera de línea.
  10. Al final de la sesión de imágenes, suspenda la anestesia con gas y permita que el animal se recupere en la placa de calentamiento en recostación esternal. Cuidar al animal hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la posición prona.

3. Post-procesamiento de imágenes de ultrasonido

  1. Abra el conjunto de datos de imágenes DICOM 3D del ganglio linfático inguinal izquierdo / derecho en la plataforma de software para el posprocesamiento de imágenes de ultrasonido.
  2. Segmentación:
    1. Seleccione Método multicorte para visualizar tanto los fotogramas actuales como las miniaturas de todos los fotogramas correspondientes a cada imagen capturada durante la adquisición 3D.
    2. Seleccione la miniatura del primer fotograma para cargarla en la vista de contorno. En la vista de contorno, haga clic con el botón izquierdo del mouse para colocar puntos a lo largo del borde del ganglio linfático. Una vez que se haya establecido el número deseado de puntos (rango 10-15), haga clic con el botón derecho para completar el contorno.
    3. Una vez completado el primer contorno, utilice la vista en miniatura para seleccionar la siguiente imagen para el contorno. Si es necesario, omita varias imágenes (promedio de 3 fotogramas) entre contornos para reducir el número de rastros manuales necesarios para cada volumen 3D.
      NOTA: La plataforma de software para el postprocesamiento de imágenes de ultrasonido generará automáticamente contornos entre trazas manuales, reduciendo así el tiempo de análisis.
    4. Repita este proceso hasta que se haya esbozado todo el volumen. Una vez completado, haga clic en Finalizar.
  3. Generación del wireframe 3D y medición de volumen:
    1. Mientras esté en el espacio de trabajo de la ventana de modo 3D , haga clic en el icono De medición de volumen debajo del área de visualización de la imagen para activar la vista de superficie.
      Nota : la vista de superficie crea una vista de compilación que asigna el volumen generado por el usuario a la imagen adquirida. La vista de superficie se puede girar en cualquier posición deseada.
    2. Tome nota de la medición de volumen que aparece en la esquina inferior izquierda de la vista del cubo.
      NOTA: La segmentación y la generación de volumen 3D también se pueden obtener utilizando software desarrollado a medida y / o software comercial / disponible gratuitamente para el procesamiento general de imágenes. A partir de la segmentación manual, el software debe proporcionar una descripción matemática y / o a nivel de píxel de los contornos de los ganglios linfáticos. Estos contornos se combinarían en un espacio 3D para representar la superficie externa de los ganglios linfáticos. Todos los pasos descritos en el procedimiento de obtención de imágenes y el post-procesamiento de imágenes de ultrasonido se resumen en la Figura 2.

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Representative Results

Después de la pintura de la piel de los ratones Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox con 4-HT, se induce la actividad de Cre, debido a que hay un cambio a nivel genómico de wt Braf a BrafV600E, mientras que Pten se pierde (Figura 3A). En 2-3 semanas, los ratones desarrollan tumores primarios en el sitio con una penetrancia del 100%. Después de cuatro semanas desde el tratamiento con 4-HT (t0), los tumores primarios alcanzan un volumen de 50-100 mm3, y su crecimiento puede ser medido por pinzas durante 2 semanas adicionales ((t1 y t2; Figura 3B, paneles superiores). No se pueden alcanzar puntos de tiempo posteriores porque el tumor se vuelve tan grande que los ratones requieren eutanasia.

En lo que respecta a la carga metastásica, se observa un aumento gradual de la pigmentación en los ganglios linfáticos inguinales dentro de las 4-6 semanas posteriores al tratamiento con 4-HT (Figura 3B, paneles inferiores). Tal aumento en la pigmentación se debe a la presencia de depósitos de melanina, como se puede confirmar por la tinción de hematoxilina y eosina realizada sin eliminar la melanina. A su vez, los depósitos de melanina se deben invariablemente a la presencia de células de melanoma metastásicas, como lo confirma la tinción inmunohistoquímica (IHC) del antígeno del melanoma MLANA y de BRAFV600E (Figura 3C).

La acumulación de células pigmentadas de melanoma dentro de los ganglios linfáticos inguinales se acompaña de un aumento progresivo de su volumen, como se evidencia mediante la inspección visual (Figura 3B, paneles inferiores). La ecografía ofrece la oportunidad única de cuantificar dicho aumento longitudinalmente, en cada ratón experimental, como se describió anteriormente16. Las mediciones volumétricas, los resultados de segmentación y la representación 3D, todos referidos a un caso representativo, se muestran en la Figura 4. El volumen de cada ganglio linfático se obtiene mediante la segmentación manual de las secciones axiales adquiridas durante una exploración 3D.

Al final de la fase de segmentación, todas las secciones muestran la superposición del contorno externo del ganglio linfático (Figura 4A). Estos contornos se conectan fotograma a fotograma en la fase de renderizado, y la superficie externa de todo el ganglio linfático se proyecta en el espacio 3D. Como ejemplo representativo, la representación 3D de un ganglio linfático inguinal derecho analizado en t0, t1 y t2 se muestra en la Figura 4B, figura 4C y Figura 4D, respectivamente. El gráfico de la Figura 4E cuantifica el aumento de volumen mostrado por los ganglios linfáticos inguinales izquierdo y derecho del mismo animal a lo largo del tiempo.

Figure 1
Figura 1: El sistema de imágenes de ultrasonido utilizado para monitorear el aumento de volumen de los ganglios linfáticos inguinales en el modelo de melanoma de ratón genéticamente modificado Braf / Pten. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Resumen paso a paso del procedimiento de obtención de imágenes y el posprocesamiento de las imágenes de ultrasonido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Inspección visual y análisis histológicos de los ganglios linfáticos inguinales en el modelo de melanoma metastásico Braf/Pten específico del tejido e inducible en el ratón. (A) La enzima Cre provoca el cambio de wt Braf a BrafV600E y la pérdida de Pten (escisión de los exones 4 y 5). Este sistema es específico de los melanocitos porque la expresión de la enzima Cre está bajo el control del promotor de la tirosinasa, una enzima involucrada en la síntesis de melanina. Por lo tanto, los dos golpes oncogénicos están restringidos al linaje melanocítico. Este sistema también es inducible porque Cre se expresa como una proteína de fusión con el receptor de estrógenos y requiere pintura de la piel con 4-HT para ser translocado en el núcleo, donde puede ejercer su función. (B) La aparición de tumores primarios de melanoma (cuadros superiores) y ganglios linfáticos inguinales (cuadros inferiores) después de 4, 5 y 6 semanas después del tratamiento con 4-HT (t0, t1 y t2, respectivamente). En los ganglios linfáticos, el aumento en la acumulación y el tamaño de la melanina se detecta mediante inspección visual. Barras de escala = 0,5 cm (imágenes superiores); 0,2 cm (imágenes inferiores). (C) Análisis histológicos de ganglios linfáticos inguinales, 6 semanas después del tratamiento con 4-HT. (arriba a la izquierda) Tinción de H&E: los depósitos de melanina se eliminan incubando rodajas con 1% de KOH y 3% de H2O2.  (arriba a la derecha) Detección de melanina realizada mediante tinción H&E sin tratamiento con 1% de KOH y 3% de H2O2. (abajo a la izquierda) Detección de MLANA por tinción de inmunoperoxidasa (sustrato de cromógeno DAB y contratinción de hematoxilina). (abajo a la derecha) Detección de BRAFV600E por tinción de inmunoperoxidasa (sustrato cromógeno DAB y contratinción de hematoxilina). Para todos los paneles, aumento original: 40x; barras de escala = 20 μm. Abreviaturas: wks = semanas; wt = tipo salvaje; 4-HT = 4-hidroxitamoxifeno; H&E = hematoxilina y eosina; DAB = 3,3'-diaminobenzidina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Mediciones, segmentación y representación 3D del volumen de los ganglios linfáticos inguinales en el modelo de melanoma metastásico Braf/Pten específico del tejido e inducible en el ratón. (A) Superposición de los contornos externos del ganglio linfático inguinal derecho en 4 secciones escaneadas representativas obtenidas por segmentación manual. (B-D) Representación del volumen 3D del ganglio linfático inguinal derecho, medido a las 4, 5 y 6 semanas después del tratamiento con 4-HT (puntos de tiempo t0, t1 y t2, respectivamente). También se informa el valor numérico del volumen (en mm3). (E) El volumen del ganglio linfático inguinal izquierdo (círculo negro) y derecho (círculo blanco) del mismo animal en los puntos de tiempo t0, t1 y t2. Abreviaturas: 3D = tridimensional; 4-HT = 4-hidroxitamoxifeno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los datos obtenidos en este estudio atestiguan la capacidad de las imágenes ecográficas para monitorizar la afectación metastásica de los ganglios linfáticos inguinales del modelo de ratón Braf/Pten de melanoma metastásico. Como se ha demostrado anteriormente16, esta técnica es especialmente útil para evaluar la eficacia del tratamiento farmacológico. Esto se debe a que permite el seguimiento del cambio en el volumen de los ganglios linfáticos en un mismo animal a lo largo del tiempo, comparando las mediciones recogidas en t1 y  t2 con las recogidas en t0. Esto, a su vez, contribuye a un aumento en la robustez de los resultados obtenidos, porque se tiene en cuenta la variabilidad entre ratones y otros factores que podrían influir en el tamaño de los ganglios linfáticos basales. Además, la ecografía permite el cumplimiento del principio 3R al reducir el número de animales por grupo experimental.

En ratones Braf/Pten, no solo los ganglios linfáticos inguinales, sino también braquiales y axilares son sitios de diseminación metastásica. Sin embargo, es recomendable centrarse en los ganglios linfáticos inguinales porque los demás están demasiado cerca del sitio del tumor primario, lo que generalmente altera su localización y morfología durante el desarrollo del tumor primario en sí. Alternativamente, los ganglios linfáticos braquiales y axilares podrían ser adecuados para la ecografía si se elige un sitio diferente de inducción tumoral, como orejas o patas8. En lo que respecta a otros sitios metastásicos, los pulmones no se pueden estudiar mediante imágenes de ultrasonido, debido a la presencia de aire en el tejido. Teóricamente, solo las metástasis pulmonares superficiales que alcanzan la interfaz pleural podrían visualizarse con esta técnica. Aunque en su lugar se podría utilizar la tomografía micro computarizada/tomografía por emisión de positrones (TC/PET), este enfoque tiene varios inconvenientes, incluidos los altos costos y la disponibilidad limitada. Además, al estar basado en radiaciones ionizantes, el micro CT/PET es difícilmente compatible con mediciones longitudinales en múltiples puntos de tiempo. Por el contrario, la ecografía se puede aplicar fácilmente al estudio de las metástasis subcutáneas y permite la medición tanto del volumen como de la vascularización16.

Si un marco de tiempo de 2 semanas es demasiado corto para apreciar los efectos del fármaco en estudio, se podría seleccionar un sitio de inducción más periférico (por ejemplo, la punta de la cola9,11) o un genotipo menos propenso a tumores (Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/+ ratones en lugar de Tyr::CreER+, BrafCA/+, Ptenlox/lox ratones)9 . En ambos casos, se espera que el crecimiento del tumor primario sea mucho más lento, lo que permite la monitorización de metástasis durante mucho más de 6 semanas después de la inducción con 4-HT.

Desde un punto de vista más técnico, es importante tener en cuenta que la segmentación 2D de las imágenes de ultrasonido es el paso más crítico en este protocolo, ya que puede afectar la medición del volumen 3D. Afortunadamente, en el modelo animal braf/pten, el contraste entre los ganglios linfáticos y los tejidos circundantes es bastante marcado, por lo que el contorno de los bordes de los ganglios linfáticos por segmentación manual es relativamente simple. Sin embargo, el proceso de segmentación debe ser facilitado por la alta calidad de las imágenes de ultrasonido adquiridas por el ecografista, quien, a su vez, debe ser altamente experimentado y enfocado en adquirir la misma proyección ecográfica del ganglio linfático, incluso en sesiones de exploración realizadas en diferentes puntos de tiempo.

Las imágenes de ultrasonido en modo B no pueden resaltar las células cancerosas directamente; en cambio, permite la inferencia de su presencia a partir del aumento en el volumen de los ganglios linfáticos inguinales. A la luz de esta información, se recomienda que las imágenes de ultrasonido se combinen con la tinción IHC adecuada de los ganglios linfáticos, de modo que se pueda confirmar la presencia de células cancerosas a nivel molecular. Sin embargo, un agrandamiento de los ganglios linfáticos observado en un ratón Braf/Pten inducido es típicamente atribuible a la propagación del cáncer y no a alguna otra causa, por ejemplo, una infección en curso. Esto es probable porque los ratones experimentales utilizados para imágenes de ultrasonido se crían en condiciones controladas y se someten rutinariamente a exámenes sanitarios, de modo que la enfermedad se detecta y trata rápidamente.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a S. Burchielli (FTGM, Pisa) por su ayuda con los procedimientos con animales. Este trabajo fue apoyado por ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica financiación institucional a LP; MFAG #17095 otorgado por AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro a LP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-hydroxytamoxifen Merck H6278 drug used for tumor induction
B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice The Jackson Laboratory 013590
Blu gel Sooft Ialia ophthalmic solution gel
BRAFV600E antibody Spring Bioscience Corporation E19290
IsoFlo (isoflorane) Zoetis liquid for gaseous anaesthesia
MLANA antibody Thermo Fisher Scientific M2-7C10
Sigma gel Parker electrode gel
Transonic gel clear Telic SAU ultrasound gel
Veet Reckitt Benckiser IT depilatory cream
Compact Dual Anesthesia System Fujifilm, Visualsonics Inc. Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber
MX550S Fujifilm, Visualsonics Inc. UHFUS linear probe
Vevo 3100 Fujifilm, Visualsonics Inc. UHFUS system
Vevo Imaging Station Fujifilm, Visualsonics Inc. UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board
Vevo Lab Fujifilm, Visualsonics Inc. software platform for ultrasound image post-processing

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References

  1. Schvartsman, G., et al. Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663 (2019).
  2. Blum, A., et al. Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma - Results of a prospective study of 1288 patients. Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).
  3. Olmedo, D., et al. Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis. Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).
  4. Voit, C., et al. Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma. Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).
  5. Hayes, A. J., et al. Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma. British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).
  6. Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients. Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).
  7. Jayapal, N., et al. Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, Suppl 2 338-346 (2019).
  8. Dankort, D., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
  9. Damsky, W. E., et al. β-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas. Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).
  10. Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma. Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).
  11. Kohler, C., et al. Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes. Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).
  12. Yuan, P., et al. Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).
  13. Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).
  14. Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma. American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).
  15. Steinberg, S. M., et al. BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma. Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).
  16. Vitiello, M., et al. Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma. Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).
  17. Moon, H., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
  18. Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma. Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).

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