ヒトの一次源または造血前駆体からの分化 インビトロ からのヒトMKの免疫フェノタイピングと細胞選別
Summary
ここでは、巨核球分化の特徴付けに関する免疫型付け戦略を紹介し、その戦略が蛍光活性化細胞選別機を用いて異なる段階で巨核球を選別する方法を示す。この方法論はヒトの一次組織に適用できるが、 インビトロの培養で生成された巨核球にも適用できる。
Abstract
巨核球(MK)分化は、非常に多倍(>64Nに達する)および非常に大きな細胞(40-60 μm)をもたらす多くのエンドミトティックサイクルを包含する。細胞生物学と分子レベルでの巨核代の急速な知識とは対照的に、フローサイトメトリーによる巨核生物の特徴付けは、系統特異的な表面マーカーを用いた成熟したMCの同定に限定される一方、以前のMK分化段階は未踏のままである。ここでは、MK特異的および非特異的な表面マーカーを含むパネルを用いたヒトの一次源または インビトロ 培養において、連続したMK分化段階の同定を可能にする免疫フェノタイピング戦略を提示する。その大きさと脆弱性にもかかわらず、MKは上記のパネルを使用して免疫フェノタイプすることができ、圧力およびノズル直径の特定の条件下で蛍光活性化細胞選別によって濃縮される。このアプローチは、ヒトにおける巨核代と血小板産生の複雑性をよりよく理解することを目的として、マルチオミックス研究を促進する。巨核代の特徴付けが良いと、系統関連の病理や悪性腫瘍の診断や予後に根本的なものとなる可能性があります。
Introduction
巨核球(MC)は、主にホルモントロンボポエチン(TPO)によって調整される巨核球症と呼ばれる複雑なプロセスに続いて、造血幹細胞(HSC)から発症する。巨核代の古典的な見解は、HSCからの細胞の旅を、コミットされた前駆細胞および前駆細胞の階層的な段階の連続を通して記述し、最終的には成熟したMKにつながる。成熟の間、MKはエンドミドーシスの複数のラウンドを経験し、血小板産生のための十分な膜表面を提供する複雑な細胞内境界膜系(DMS)を開発し、成熟した血小板1、2、3によって受け継がれる異なる顆粒に含まれる多数の因子を効率的に生成し、パックする。その結果、成熟したMKは、高倍数核(>64Nにも達する)を特徴とする大細胞(40〜60μm)です。最近の研究では、HSCが特定の生理病理学的状態4、5、6、7、8、9、10、11に応答して従来の系統コミットメントチェックポイントをバイパスしてMKに分化する代替ルートを示唆している。これらの知見は、成熟したMKに対する造血性分化が生物学的ニーズに対応する連続的かつ適応的なプロセスであることを強調している。
細胞生物学に関する知識の増加と巨核代種症12の分子的側面に関する知識が高まる中、フローサイトメトリーによるプロセスの研究に特化した研究のほとんどは、系統特異的な表面マーカー(CD42A/B、CD41/CD61)を用いた成熟したMCの同定に限定されているが、MK分化段階は未踏のままである。我々は以前に、ヒト15に適応し、適用してきたマウス骨髄および骨髄由来MK培養13、14において巨核代を上演する戦略を文書化した。本稿では、ヒトの主要なソース(骨髄-BM-および末梢血-PB-)またはMK特異的および非特異的表面マーカー(CD61、CD42B、CD49B、CD31、CD71)を組み込んだパネルを用いたインビトロ培養物において、HSCから成熟したMCまで、巨核化の特徴を可能にする免疫フェノタイピング戦略を示す。MKは、大きなサイズと脆弱性にもかかわらず、上記の細胞表面マーカーを使用して免疫整形され、細胞の破裂や損傷を最小限に抑えるために、圧力とノズル径の特定の条件下で蛍光活性化細胞選別によって濃縮することができます。この技術は、人間の健康と病気における巨核代と血小板産生の複雑さをよりよく理解することを目的として、マルチオミクスのアプローチを促進する。注目に値する、それは需要の増大の臨床文脈で診断と予後を助けるために有用なツールとして提起する。
この原稿では、MK特異的および非特異的な表面マーカーを主要なソースまたは生成されたインビトロから統合したパネルを用いて、ヒト巨核代を上演する戦略を文書化する。さらに、蛍光活性化細胞選別機、好ましい分数および成熟したMKを用いて、並べ替えプロトコルを提供します(図1)。この手順は、サイズが大きく、また、MK の脆弱性が大きいため、技術的に難しいため、一般的ではありません。しかし、それは以前マウスとヒト骨髄サンプルの両方で採用されており、技術の進歩により、毎回16、17、18より良い結果が得られます。MCまたはMK前駆体を研究できるヒトの主要な情報源には、骨髄、臍帯血および末梢血などが含まれる。各サンプルの分析のために関連する細胞分数を分離するための適切なサンプル処理が重要です。標準的な手順を組み込み、巨大核代の研究を目指す際に考慮すべきいくつかの考慮事項があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
フローサイトメトリーによる巨核生物の研究に焦点を当てた研究のほとんどは、系統特異的な表面マーカー(すなわち、CD42A/CD42B、CD41/CD61)のみを使用したMKサブセットの同定に限定され、以前のMK分化段階は十分に検討されていません。本稿ではヒト巨核代の包括的なフローサイトメトリー特性解析に取り組む免疫フェノタイピング戦略を示す。全体として、MK特異的および非特異的な表…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
マルコス・ペレス・バステルレチェア、ロレナ・ロドリゲス・ロレンツォ、ベゴーニャ・ガルシア・メンデス(HUCA)、パロマ・セレッソ、アルムデナ・パエロ、マリア・デ・ラ・ポベダ=コロモ(HCSC)に技術サポートを感謝します。この研究は、A.B.、RYCフェローシップ(RYC-2013-12587)への医療助成金(ロシュSP200221001)によって部分的にサポートされました。デ・エコノミア・イ・コンペティティビダード、スペイン)とI +D 2017助成金(SAF2017-85489-P;シエンシア大臣、イノバシオン・イ・ウニバーシダーデス、スペイン、フォンドス・フェデエル)からセベロ・オチョア・グラント(PA-20-PF-BP19-014)までコンセヘリア・デ・シエンシア,イノバシオン・イ・ウニヴェルシダーデス・デル・プリンシパド・デ・アストゥリアス州)からP.M.-Bへ。そして、A.A.-Hへの壁内ポスドク助成金2018(フンダシオン・パラ・ラ・インベスティガシオン・イ・ラ・イノバシオン・ビバイサニタリア・デ・アストゥリアス – FINBA、オビエド、スペイン)。私たちは、彼の知識(と時間)、特にマルチカラータグ付き抗体パネルミックスと単色ビーズ制御製剤に関する彼の賢明なアドバイスを共有してくれたライニエ・ファン・デル・リンデンに感謝します。
Materials
| 130 micron Nozzle | BD | 643943 | required for MK sorting |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| A-4-62 Swing Bucket Rotor | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge | ELITech Group | Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa | |
| CO2 Incubator Galaxy 170 S | Eppendorf | Cell Incubation | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | To prepare cytospins | |
| FACSAria IIu sorter | BD | Lasers 488-nm and 633-nm | |
| FACSCanto II flow cytometer | BD | Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm | |
| Olympus Microscope BX 41 | Olympus | Microphotographs | |
| Olympus Microscope BX 61 | Olympus | Microphotographs | |
| Zoe Fluorescent Cell Imager | BioRad | Microphotographs | |
| To obtain PBMCs | |||
| Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum | Sigma-Aldrich | L4646 | or similar |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07801 | or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | or similar |
| Recombinant human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | or similar |
| Recombinant human stem cell factor (SCF) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC2115 | or similar |
| Recombinant human thrombopoietin (TPO) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC9514 | or TPO receptor agonists |
| StemSpan SFEM | Stem Cell Technologies | #09650 | |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A7906-100G | or similar |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | Antibodies for human cells are generally from mouse. |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | or similar |
| BD FACS Accudrop Beads | BD | 345249 | |
| CD31 AF-647 | BD | 561654 | Mouse anti-human |
| CD31 FITC | Immunostep | 31F-100T | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | Mouse anti-human |
| CD41 PE | BD | 555467 | Mouse anti-human |
| CD41 PerCP-Cy5.5 | BD | 333148 | Mouse anti-human |
| CD42A APC | Immunostep | 42AA-100T | We observed unspecific binding… that needs to be assessed |
| CD42A PE | BD | 558819 | Mouse anti-human |
| CD42B PerCP | Biolegend | 303910 | Mouse anti-human |
| CD49B PE | BD | 555669 | Mouse anti-human |
| CD61 FITC | BD | 555753 | Mouse anti-human |
| CD71 APC-Cy7 | Biolegend | 334109 | Mouse anti-human |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | Fc blocking – control |
| KIT PE-Cy7 | Biolegend | 313212 | Mouse anti-human |
| Lineage Cocktail 2 FITC | BD | 643397 | Mouse anti-human |
| RNAse | Merck | R6513 | or similar |
| Triton X-500 | Merck | 93443-500ML | or similar |
| Cell strainers for sorting | |||
| CellTrics Filters 100 micrometers | Sysmex | 04-004-2328 | Cell strainers |
| Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols – unless otherwise specified. | |||
References
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