İnsan Birincil Kaynaklarından veya Hematopoetik Progenitörlerden Farklılaştırılmış In Vitro'dan İnsan MK'larının İmmünofenoping ve Hücre Sıralama
Summary
Burada, megakaryosit farklılaşmasının karakterizasyonu için bir immünofenotyping stratejisi sunuyoruz ve bu stratejinin floresan ile aktive edilmiş bir hücre sıralayıcısı ile megakaryositlerin farklı aşamalarda sıralanmasına nasıl izin verdiğini gösteriyoruz. Metodoloji insan birincil dokularına uygulanabilir, aynı zamanda kültür in vitroundaüretilen megakaryositlere de uygulanabilir.
Abstract
Megakaryosit (MK) farklılaşması, yüksek poliploid (hatta >64N’ye) ve son derece büyük bir hücreye (40-60 μm) neden olan bir dizi endomitotik döngüyü kapsar. Hücre biyolojisi ve moleküler düzeyde megakaryopoeziste hızla artan bilginin aksine, megakaryopoezisin akış sitometrisi ile karakterizasyonu, olgun MK’lerin soyuna özgü yüzey belirteçleri kullanılarak tanımlanmasıyla sınırlıdır, daha önceki MK farklılaşma aşamaları ise keşfedilmemiştir. Burada, insan birincil kaynaklarında veya in vitro kültürlerde art arda gelen MK farklılaşma aşamalarının, MK spesifik ve spesifik olmayan yüzey belirteçlerini entegre eden bir panelle tanımlanmasını sağlayan bir immünofenomileme stratejisi sunuyoruz. Boyutuna ve kırılganlığına rağmen, MK’ler yukarıda belirtilen panel kullanılarak immünofenotipe edilebilir ve belirli basınç ve nozül çapı koşulları altında floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama ile zenginleştirilebilir. Bu yaklaşım, insanlarda megakaryopoez ve trombosit üretiminin karmaşıklığını daha iyi anlamak amacıyla çoklu Omics çalışmalarını kolaylaştırır. Megakaryopoezisin daha iyi nitelendirmesi, soyla ilgili patolojilerin ve malignitenin tanısında veya prognozunda temel teşkil edebilir.
Introduction
Megakaryositler (MKs), özellikle trombopoietin (TPO) hormonu tarafından düzenlenen megakaryopoezis adı verilen karmaşık bir sürecin ardından hematopoetik kök hücrelerden (HSC’ ler) gelişir. Megakaryopoezis’in klasik görünümü, HSC’lerden, taahhüt edilen ataların ve öncü hücrelerin hiyerarşik aşamalarının ardışık olarak ardışık olarak hücresel yolculuğunu açıklar ve sonuçta olgun bir MK’ye yol açan. Olgunlaşma sırasında, MK’ler birden fazla endokatoz turu yaşar, trombosit üretimi için yeterli membran yüzeyi sağlayan karmaşık bir hücre içi sınır membran sistemi (DMS) geliştirir ve olguntrombositler1,2,3tarafından miras kalan farklı granüllerde bulunan faktörlerin bolluğunu verimli bir şekilde üretir ve paketler. Sonuç olarak, olgun MK’ler oldukça poliploid bir çekirdekle karakterize edilen büyük hücrelerdir (40-60 μm) (>64N’ye bile ulaşır). Son çalışmalar, HSC’lerin belirli fizyo-patolojik koşullara yanıt olarak geleneksel soy taahhüt kontrol noktalarını atlayarak MK’lere farklılık gösterdiği alternatif rotalar önermektedir4,5,6,7,8,9,10,11. Bu bulgular, olgun MK’ya karşı hematopoetik farklılaşmanın biyolojik ihtiyaçlara cevap veren sürekli ve uyarlanabilir bir süreç olduğunu vurgulamaktadır.
Hücre biyolojisi ve megakaryopoezis12’yikarakterize eden moleküler yönler hakkında artan bilgi ile, sürecin akış sitometrisi ile incelenmesine adanmış araştırmaların çoğu, olgun MK’lerin soyuna özgü yüzey belirteçleri (cd42A /B, CD41 / CD61) kullanılarak tanımlanmasıyla sınırlıdır, daha önceki MK farklılaşma aşamaları ise keşfedilmemiştir. Daha önce megakaryopoez’i fare kemik iliği ve kemik iliği türevi MK kültürlerinde sahneleme stratejisini belgeledik13,14, uyarladık ve insanlara uyguladık15. Bu yazıda megakaryopoezlerin karakterizasyonuna izin veren bir immünofenomipi stratejisi gösteriyoruz, HSC’lerden olgun MK’lere, insan birincil kaynaklarında (kemik iliği -BM- ve periferik kan -PB-) veya in vitro kültürlerde MK’ye özgü ve spesifik olmayan yüzey belirteçlerini (CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT ve CD71) entegre eden bir panel kullanarak. Büyük boyutuna ve kırılganlığına rağmen, MK’ler yukarıda belirtilen hücre yüzeyi belirteçleri kullanılarak immünofipotip edilebilir ve hücre yırtılmasını ve/veya hasarını en aza indirmek için belirli basınç ve nozül çapı koşullarında floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama ile zenginleştirilebilir. Bu teknik, megakaryopoez ve trombosit üretiminin insan sağlığı ve hastalığındaki karmaşıklığını daha iyi anlamak amacıyla çoklu Omics yaklaşımlarını kolaylaştırır. Dikkat çekici, artan talebin klinik bağlamında tanı ve prognoza yardımcı olmak için yararlı bir araç olarak ortaya çıkacaktır.
Bu yazıda, birincil kaynaklardan MK’ya özgü ve spesifik olmayan yüzey belirteçlerini entegre eden veya in vitrooluşturulan bir panel ile insan megakaryopoezini sahneleme stratejisini belgeleyeceğiz. Ayrıca, floresanla etkinleştirilmiş bir hücre sıralayıcısı, tercih edilen kesirler ve olgun MK’ler ile sıralamak için bir protokol sağlıyoruz (Şekil 1). Bu adım popüler değildir, çünkü MK’lerin büyüklüğü ve kırılganlığı nedeniyle teknik olarak zordur. Bununla birlikte, daha önce hem fare hem de insan kemik iliği örneklerinde ve teknolojik ilerleme nedeniyle, her seferinde daha iyi bir sonuçla16,17,18. MK’lerin veya MK öncüllerinin çalışılabildiği insan birincil kaynakları arasında kemik iliği, kordon kanı ve periferik kan bulunur. Her numune üzerinde analiz için ilgili hücre fraksiyonunu izole etmek için uygun numune işleme önemlidir. Standart prosedürler, megakaryopoez çalışmasını hedeflerken dikkate alınması gereken bazı hususlarla dahil edilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Megakaryopoezisin akış sitometrisi ile incelenmesine odaklanan araştırmaların çoğu, bugüne kadar MK alt kümelerinin sadece soyunaözgü yüzey belirteçleri (cd42A/CD42B, CD41/CD61) kullanılarak tanımlanmasıyla sınırlıyken, daha önceki MK farklılaşma aşamaları kötü incelenmiştir. Bu makalede, insan megakaryopoezisinin kapsamlı bir akış sitometrisi nitelemesi ele almak için bir immünofenotipleme stratejisi gösteriyoruz. Genel olarak, megakaryopoezisin daha ayrıntılı bir şekilde in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Teknik destek için Marcos Pérez Basterrechea, Lorena Rodríguez Lorenzo ve Begoña García Méndez (HUCA) ve Paloma Cerezo, Almudena Payero ve María de la Poveda-Colomo’ya (HCSC) teşekkür ederiz. Bu çalışma, RYC bursu olan A.B.’ye Tıbbi Hibeler (Roche SP200221001) tarafından kısmen desteklendi (RYC-2013-12587; Ministerio de Economía y Competitividad, İspanya) ve I+D 2017 hibesi (SAF2017-85489-P; Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, İspanya ve Fondos FEDER) L.G.’ye, severo Ochoa Grant ‘e (PA-20-PF-BP19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades del Principado de Asturias, İspanya) p.M.-B. ve A.A.-H’ye intramural doktora sonrası hibe 2018 (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Asturias – FINBA, Oviedo, İspanya). Reinier van der Linden’e bilgilerini (ve zamanını) paylaştığı için teşekkür ederiz, özellikle çok renkli etiketli antikor paneli karışımı ve tek renkli boncuk kontrolü hazırlığı hakkındaki bilge tavsiyeleri.
Materials
| 130 micron Nozzle | BD | 643943 | required for MK sorting |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| A-4-62 Swing Bucket Rotor | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge | ELITech Group | Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa | |
| CO2 Incubator Galaxy 170 S | Eppendorf | Cell Incubation | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | To prepare cytospins | |
| FACSAria IIu sorter | BD | Lasers 488-nm and 633-nm | |
| FACSCanto II flow cytometer | BD | Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm | |
| Olympus Microscope BX 41 | Olympus | Microphotographs | |
| Olympus Microscope BX 61 | Olympus | Microphotographs | |
| Zoe Fluorescent Cell Imager | BioRad | Microphotographs | |
| To obtain PBMCs | |||
| Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum | Sigma-Aldrich | L4646 | or similar |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07801 | or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | or similar |
| Recombinant human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | or similar |
| Recombinant human stem cell factor (SCF) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC2115 | or similar |
| Recombinant human thrombopoietin (TPO) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC9514 | or TPO receptor agonists |
| StemSpan SFEM | Stem Cell Technologies | #09650 | |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A7906-100G | or similar |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | Antibodies for human cells are generally from mouse. |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | or similar |
| BD FACS Accudrop Beads | BD | 345249 | |
| CD31 AF-647 | BD | 561654 | Mouse anti-human |
| CD31 FITC | Immunostep | 31F-100T | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | Mouse anti-human |
| CD41 PE | BD | 555467 | Mouse anti-human |
| CD41 PerCP-Cy5.5 | BD | 333148 | Mouse anti-human |
| CD42A APC | Immunostep | 42AA-100T | We observed unspecific binding… that needs to be assessed |
| CD42A PE | BD | 558819 | Mouse anti-human |
| CD42B PerCP | Biolegend | 303910 | Mouse anti-human |
| CD49B PE | BD | 555669 | Mouse anti-human |
| CD61 FITC | BD | 555753 | Mouse anti-human |
| CD71 APC-Cy7 | Biolegend | 334109 | Mouse anti-human |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | Fc blocking – control |
| KIT PE-Cy7 | Biolegend | 313212 | Mouse anti-human |
| Lineage Cocktail 2 FITC | BD | 643397 | Mouse anti-human |
| RNAse | Merck | R6513 | or similar |
| Triton X-500 | Merck | 93443-500ML | or similar |
| Cell strainers for sorting | |||
| CellTrics Filters 100 micrometers | Sysmex | 04-004-2328 | Cell strainers |
| Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols – unless otherwise specified. | |||
References
- Italiano, J. E. Unraveling Mechanisms That Control Platelet Production. Semin Thrombosis And Haemostasis. 39 (1), 15-24 (2013).
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The Incredible Journey: From Megakaryocyte Development To Platelet Formation. Journal Of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Eckly, A., et al. Biogenesis Of The Demarcation Membrane System (DMS) In Megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Couldwell, G., Machlus, K. R. Modulation Of Megakaryopoiesis And Platelet Production During Inflammation. Thrombosis Research. 179, 114-120 (2019).
- Kosaki, G. In Vivo Platelet Production From Mature Megakaryocytes: Does Platelet Release Occur Via Proplatelets. International Journal Of Hematology. 81 (3), 208-219 (2005).
- Lefrancais, E., Looney, M. R. Platelet Biogenesis In The Lung Circulation. Physiology (Bethesda). 34 (6), 392-401 (2019).
- Nieswandt, B., Stritt, S. Megakaryocyte Rupture For Acute Platelet Needs. Journal Of Cell Biology. 209 (3), 327-328 (2015).
- Nishimura, S., et al. IL-1alpha Induces Thrombopoiesis Through Megakaryocyte Rupture In Response To Acute Platelet Needs. Journal Of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-Biased Stem Cells Reside At The Apex Of The Haematopoietic Stem-Cell Hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Notta, F., et al. Distinct Routes Of Lineage Development Reshape The Human Blood Hierarchy Across Ontogeny. Science. 351 (6269), 2116 (2016).
- Yamamoto, R., et al. Clonal Analysis Unveils Self-Renewing Lineage-Restricted Progenitors Generated Directly From Hematopoietic Stem Cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
- Wang, H., et al. Decoding Human Megakaryocyte Development. Cell Stem Cell. , (2020).
- Meinders, M., et al. Repercussion Of Megakaryocyte-Specific Gata1 Loss On Megakaryopoiesis And The Hematopoietic Precursor Compartment. Plos One. 11 (5), 0154342 (2016).
- Meinders, M., et al. Sp1/Sp3 Transcription Factors Regulate Hallmarks Of Megakaryocyte Maturation And Platelet Formation And Function. Blood. 125 (12), 1957-1967 (2015).
- Salunkhe, V. P., Gutiérrez, L. Culture Of Megakaryocytes From Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Bio-Protocol. 5 (21), 1639 (2015).
- Choudry, F. A., et al. Transcriptional Characterization Of Human Megakaryocyte Polyploidization And Lineage Commitment. Journal Of Thrombosis And Haemostasis. , 15271 (2021).
- Heazlewood, S. Y., Williams, B., Storan, M. J., Nilsson, S. K. The Prospective Isolation Of Viable, High Ploidy Megakaryocytes From Adult Murine Bone Marrow By Fluorescence Activated Cell Sorting. Methods In Molecular Biology. 1035, 121-133 (2013).
- Tomer, A., Harker, L. A., Burstein, S. A. Purification Of Human Megakaryocytes By Fluorescence-Activated Cell Sorting. Blood. 70 (6), 1735-1742 (1987).
- Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. On The Quest For In Vitro Platelet Production By Re-Tailoring The Concepts Of Megakaryocyte Differentiation. Medicina. 56 (12), (2020).
- Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. In Vitro Platelet Production For Transfusion Purposes: Where Are We Now. Transfusion And Apheresis Science. 59 (4), 102864 (2020).
- Butov, K. R., et al. In Vitro Megakaryocyte Culture From Human Bone Marrow Aspirates As A Research And Diagnostic Tool. Platelets. , 1-8 (2020).
- Di Buduo, C. A., et al. A Gold Standard Protocol For Human Megakaryocyte Culture Based On The Analysis Of 1,500 Umbilical Cord Blood Samples. Thrombosis And Haemostasis. , (2020).
