Иммунофенотипирование и сортировка клеток человеческих МК из первичных источников человека или дифференцированных in vitro от кроветворных прародителей
Summary
Здесь мы представляем стратегию иммунофенотипирования для характеристики дифференцировки мегакариоцитов и показываем, как эта стратегия позволяет сортировать мегакариоциты на разных стадиях с помощью флуоресцентно-активированного сортировщика клеток. Методика может быть применена к первичным тканям человека, а также к мегакариоцитам, образуемым в культуре in vitro.
Abstract
Дифференцировка мегакариоцитов (МК) охватывает ряд эндомитотических циклов, которые приводят к высокополиплоидной (достигающей еще >64N) и чрезвычайно большой клетке (40-60 мкм). В отличие от быстро растущих знаний о мегакариопоэсисе на клеточном биологии и молекулярном уровне, характеристика мегакариопоэтиса с помощью проточной цитометрии ограничивается идентификацией зрелых МК с использованием специфических для линии поверхностных маркеров, в то время как более ранние стадии дифференцировки МК остаются неисследованными. Здесь мы представляем стратегию иммунофенотипирования, которая позволяет идентифицировать последовательные стадии дифференцировки МК с возрастающим статусом плоидности в первичных источниках человека или культурах in vitro с панелью, объединяющей специфические и неспецифические поверхностные маркеры МК. Несмотря на свои размеры и хрупкость, МК могут быть иммунофенотипированы с использованием вышеупомянутой панели и обогащены флуоресцентно-активированной сортировкой клеток при определенных условиях давления и диаметра сопла. Этот подход облегчает мультиомические исследования с целью лучшего понимания сложности мегакариопоэтиса и производства тромбоцитов у людей. Лучшая характеристика мегакариопоэтиса может представлять собой фундаментальную в диагностике или прогнозе связанных с линией патологий и злокачественных новообразований.
Introduction
Мегакариоциты (МК) развиваются из гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) после сложного процесса, называемого мегакариопоэзом, который управляется в основном гормоном тромбопоэтином (ТПО). Классический взгляд на мегакариопоэтизис описывает клеточное путешествие от ГСК через последовательность иерархических стадий преданных предшественников и клеток-предшественников, что в конечном итоге приводит к зрелому МК. Во время созревания МК испытывают множественные раунды эндомитоза, развивают сложную внутриклеточную демаркационную мембранную систему (ДМС), которая обеспечивает достаточную поверхность мембраны для производства тромбоцитов, и эффективно производят и упаковывают множество факторов, которые содержатся в различных гранулах, унаследованных зрелыми тромбоцитами1,2,3. В результате зрелые МК представляют собой крупные клетки (40-60 мкм), характеризующиеся высокополиплоидным ядром (достигающим даже >64N). Недавние исследования предлагают альтернативные пути, по которым ГСК дифференцируются в МК, минуя традиционные контрольные точки приверженности линии в ответ на определенные физио-патологические состояния4,5,6,7,8,9,10,11. Эти результаты подчеркивают, что гемопоэтическая дифференциация в сторону зрелого МК является континуумным и адаптивным процессом, который реагирует на биологические потребности.
С ростом знаний о клеточной биологии и молекулярных аспектах, характеризующих мегакариопоэзис12,большинство исследований, посвященных изучению процесса с помощью проточной цитометрии, ограничены идентификацией зрелых МК с использованием специфических для линии поверхностных маркеров(т. Е. CD42A / B, CD41 / CD61), в то время как более ранние этапы дифференцировки МК остаются неисследованными. Ранее мы задокументировали стратегию постановки мегакариопоэсиса в культурах MK13,14,полученных из костного мозга мышей и костного мозга, которую мы адаптировали и применили к людям15. В настоящей статье показана стратегия иммунофенотипирования, позволяющая характеризовать мегакариопоэтоз, от ГСК до зрелых МК, в первичных источниках человека (костном мозге -BM- и периферической крови -PB-) или культурах in vitro с использованием панели, интегрирующей специфические и неспецифические поверхностные маркеры MK (CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT и CD71, среди прочих). Несмотря на свой большой размер и хрупкость, МК могут быть иммунофенотипированы с использованием вышеупомянутых маркеров клеточной поверхности и обогащены флуоресцентно-активированной сортировкой клеток в определенных условиях давления и диаметра сопла для минимизации разрыва и / или повреждения клеток. Этот метод облегчает мультиомические подходы с целью лучшего понимания сложности мегакариопоэтиса и производства тромбоцитов в здоровье и болезнях человека. Примечательно, что он будет представлять собой полезный инструмент для облегчения диагностики и прогнозирования в клиническом контексте растущего спроса.
В этой рукописи мы документируем стратегию постановки человеческого мегакариопоизиса с помощью панели, объединяющей МК-специфические и неспецифические поверхностные маркеры из первичных источников или сгенерированные in vitro. Кроме того, мы предоставляем протокол для сортировки с помощью сортировщика клеток, активируемого флуоресценцией, предпочтительных фракций и зрелых МК(рисунок 1). Этот шаг не популярен, так как технически сложен из-за больших размеров и хрупкости МК. Тем не менее, он использовался как в образцах костного мозга мышей, так и человека ранее, и благодаря технологическому прогрессу, с лучшим результатом каждый раз16,17,18. Человеческие первичные источники, где могут быть изучены MK или предшественники MK, включают костный мозг, пуповинную кровь и периферическую кровь, среди прочего. Правильная обработка образца для выделения соответствующей клеточной фракции для анализа на каждом образце имеет важное значение. Включены стандартные процедуры, с некоторыми соображениями, которые следует учитывать при изучении мегакариопоизиса.
Protocol
Representative Results
Discussion
Большинство исследований, сосредоточенных на изучении мегакариопоэзиса с помощью проточной цитометрии, на сегодняшний день ограничены идентификацией подмножеств МК с использованием только специфических для линии поверхностных маркеров(т.е.CD42A / CD42B, CD41 / CD61), в то время как более р…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Маркоса Переса Бастерречеа, Лорену Родригес Лоренцо и Бегонью Гарсию Мендес (HUCA) и Палому Сересо, Альмудену Пайеро и Марию де ла Поведа-Коломо (HCSC) за техническую поддержку. Эта работа была частично поддержана медицинскими грантами (Roche SP200221001) для A.B., стипендии RYC (RYC-2013-12587; Ministerio de Economía y Competitividad, Испания) и грант I+D 2017 (SAF2017-85489-P; Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Испания и Fondos FEDER) Л.Г., грант Северо Очоа (PA-20-PF-BP19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades del Principado de Asturias, Spain) до P.M.-B. и очный постдокторский грант 2018 года (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Asturias – FINBA, Oviedo, Spain) для A.A.-H. Мы благодарим Рейнира ван дер Линдена за то, что он поделился своими знаниями (и временем), особенно за его мудрые советы по многоцветной смеси антител с меткими антителами и подготовке к контролю над одноцветными шариками.
Materials
| 130 micron Nozzle | BD | 643943 | required for MK sorting |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| A-4-62 Swing Bucket Rotor | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge | ELITech Group | Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa | |
| CO2 Incubator Galaxy 170 S | Eppendorf | Cell Incubation | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | To prepare cytospins | |
| FACSAria IIu sorter | BD | Lasers 488-nm and 633-nm | |
| FACSCanto II flow cytometer | BD | Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm | |
| Olympus Microscope BX 41 | Olympus | Microphotographs | |
| Olympus Microscope BX 61 | Olympus | Microphotographs | |
| Zoe Fluorescent Cell Imager | BioRad | Microphotographs | |
| To obtain PBMCs | |||
| Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum | Sigma-Aldrich | L4646 | or similar |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07801 | or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | or similar |
| Recombinant human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | or similar |
| Recombinant human stem cell factor (SCF) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC2115 | or similar |
| Recombinant human thrombopoietin (TPO) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC9514 | or TPO receptor agonists |
| StemSpan SFEM | Stem Cell Technologies | #09650 | |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A7906-100G | or similar |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | Antibodies for human cells are generally from mouse. |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | or similar |
| BD FACS Accudrop Beads | BD | 345249 | |
| CD31 AF-647 | BD | 561654 | Mouse anti-human |
| CD31 FITC | Immunostep | 31F-100T | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | Mouse anti-human |
| CD41 PE | BD | 555467 | Mouse anti-human |
| CD41 PerCP-Cy5.5 | BD | 333148 | Mouse anti-human |
| CD42A APC | Immunostep | 42AA-100T | We observed unspecific binding… that needs to be assessed |
| CD42A PE | BD | 558819 | Mouse anti-human |
| CD42B PerCP | Biolegend | 303910 | Mouse anti-human |
| CD49B PE | BD | 555669 | Mouse anti-human |
| CD61 FITC | BD | 555753 | Mouse anti-human |
| CD71 APC-Cy7 | Biolegend | 334109 | Mouse anti-human |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | Fc blocking – control |
| KIT PE-Cy7 | Biolegend | 313212 | Mouse anti-human |
| Lineage Cocktail 2 FITC | BD | 643397 | Mouse anti-human |
| RNAse | Merck | R6513 | or similar |
| Triton X-500 | Merck | 93443-500ML | or similar |
| Cell strainers for sorting | |||
| CellTrics Filters 100 micrometers | Sysmex | 04-004-2328 | Cell strainers |
| Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols – unless otherwise specified. | |||
References
- Italiano, J. E. Unraveling Mechanisms That Control Platelet Production. Semin Thrombosis And Haemostasis. 39 (1), 15-24 (2013).
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The Incredible Journey: From Megakaryocyte Development To Platelet Formation. Journal Of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Eckly, A., et al. Biogenesis Of The Demarcation Membrane System (DMS) In Megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Couldwell, G., Machlus, K. R. Modulation Of Megakaryopoiesis And Platelet Production During Inflammation. Thrombosis Research. 179, 114-120 (2019).
- Kosaki, G. In Vivo Platelet Production From Mature Megakaryocytes: Does Platelet Release Occur Via Proplatelets. International Journal Of Hematology. 81 (3), 208-219 (2005).
- Lefrancais, E., Looney, M. R. Platelet Biogenesis In The Lung Circulation. Physiology (Bethesda). 34 (6), 392-401 (2019).
- Nieswandt, B., Stritt, S. Megakaryocyte Rupture For Acute Platelet Needs. Journal Of Cell Biology. 209 (3), 327-328 (2015).
- Nishimura, S., et al. IL-1alpha Induces Thrombopoiesis Through Megakaryocyte Rupture In Response To Acute Platelet Needs. Journal Of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-Biased Stem Cells Reside At The Apex Of The Haematopoietic Stem-Cell Hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Notta, F., et al. Distinct Routes Of Lineage Development Reshape The Human Blood Hierarchy Across Ontogeny. Science. 351 (6269), 2116 (2016).
- Yamamoto, R., et al. Clonal Analysis Unveils Self-Renewing Lineage-Restricted Progenitors Generated Directly From Hematopoietic Stem Cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
- Wang, H., et al. Decoding Human Megakaryocyte Development. Cell Stem Cell. , (2020).
- Meinders, M., et al. Repercussion Of Megakaryocyte-Specific Gata1 Loss On Megakaryopoiesis And The Hematopoietic Precursor Compartment. Plos One. 11 (5), 0154342 (2016).
- Meinders, M., et al. Sp1/Sp3 Transcription Factors Regulate Hallmarks Of Megakaryocyte Maturation And Platelet Formation And Function. Blood. 125 (12), 1957-1967 (2015).
- Salunkhe, V. P., Gutiérrez, L. Culture Of Megakaryocytes From Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Bio-Protocol. 5 (21), 1639 (2015).
- Choudry, F. A., et al. Transcriptional Characterization Of Human Megakaryocyte Polyploidization And Lineage Commitment. Journal Of Thrombosis And Haemostasis. , 15271 (2021).
- Heazlewood, S. Y., Williams, B., Storan, M. J., Nilsson, S. K. The Prospective Isolation Of Viable, High Ploidy Megakaryocytes From Adult Murine Bone Marrow By Fluorescence Activated Cell Sorting. Methods In Molecular Biology. 1035, 121-133 (2013).
- Tomer, A., Harker, L. A., Burstein, S. A. Purification Of Human Megakaryocytes By Fluorescence-Activated Cell Sorting. Blood. 70 (6), 1735-1742 (1987).
- Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. On The Quest For In Vitro Platelet Production By Re-Tailoring The Concepts Of Megakaryocyte Differentiation. Medicina. 56 (12), (2020).
- Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. In Vitro Platelet Production For Transfusion Purposes: Where Are We Now. Transfusion And Apheresis Science. 59 (4), 102864 (2020).
- Butov, K. R., et al. In Vitro Megakaryocyte Culture From Human Bone Marrow Aspirates As A Research And Diagnostic Tool. Platelets. , 1-8 (2020).
- Di Buduo, C. A., et al. A Gold Standard Protocol For Human Megakaryocyte Culture Based On The Analysis Of 1,500 Umbilical Cord Blood Samples. Thrombosis And Haemostasis. , (2020).
