인간 1차 출처에서 인간 MK의 면역페노티핑 및 세포 분류 또는 헤마토포이틱 전조자로부터 시험관내 분화
Summary
여기서는 메가카요세포 분화의 특성화를 위한 면역페노티핑 전략을 제시하고, 이 전략이 형광 활성화 세포 선별기로 다른 단계에서 메가카요사이클을 분류하는 방법을 보여준다. 방법론은 인체 에 있는 문화에서 생성된 거대 karyocytes뿐만 아니라 인간 1차 조직에적용될 수 있다.
Abstract
메가카요세포(MK) 분화는 고도의 다중계(>64N) 및 매우 큰 셀(40-60 μm)을 초래하는 다수의 내미토성 주기를 포함한다. 세포 생물학 및 분자 수준에서 메가카요포에이시스에 대한 빠르게 증가하는 지식과는 달리, 유동 세포측정에 의한 메가카르요포에이스의 특성화는 계보 특이적 표면 마커를 이용한 성숙한 MK의 식별에 국한되는 반면, 이전의 MK 분화 단계는 아직 미개척되지 않은 상태로 남아 있다. 여기서는 MK 특이적 및 비특이적 표면 마커를 통합하는 패널이 있는 인간 1차 출처 또는 체외 배양에서 연속MK 분화 단계를 식별할 수 있는 면역페노티핑 전략을 제시합니다. 그 크기와 취약성에도 불구하고, MK는 위에서 언급한 패널을 사용하여 면역페노타입이 될 수 있으며, 압력 및 노즐 직경의 특정 조건하에서 형광 활성화 셀 분류에 의해 농축될 수 있다. 이 접근은 인간에 있는 거대 karyopoiesis 및 혈소판 생산의 복잡성을 더 잘 이해하기 위하여 목적으로, 다중 Omics 연구 결과를 촉진합니다. 메가카요포이스의 더 나은 특성화는 혈통 관련 병리학 및 악성종양의 진단 또는 예후에서 근본적인 자세를 취할 수 있습니다.
Introduction
메가카요세포(MKs)는 조혈줄기세포(HSC)로부터 개발되어 호르몬 혈전포이에틴(TPO)에 의해 주로 오케스트레이션되는 메가카요포이에이시스(megakaryopoiesis)라는 복잡한 과정을 거쳐 개발한다. 메가카요포이시스의 고전적인 견해는 HSC에서 부터 헌신적인 선조및 전구체 세포의 계층적 단계를 통해 세포 여행을 설명하며 궁극적으로 성숙한 MK로 이어집니다. 성숙 하는 동안, MKs 는 여러 차례의 내시경증을 경험하고, 혈소판 생산을 위한 충분한 멤브레인 표면을 제공하는 복잡한 세포내 경계 막 시스템(DMS)을 개발하고, 성숙한 혈소판1,2,3에의해 상속되는 다양한 과립에 포함된 과다를 효율적으로 생산하고 포장한다. 그 결과, 성숙한 MK는 고다형성 핵(심지어 >64N에 도달)을 특징으로 하는 큰 세포(40-60 μm)이다. 최근 연구에 따르면 HSC가 특정 물리 병리학적조건에 대한 응답으로 전통적인 혈통 약정 체크 포인트를 우회하는 MK로 분화하는 대체 경로를제안4,5,6,7,9,10,11. 이러한 사실 인정은 성숙한 MK를 향한 조혈 분화가 생물학 필요에 반응하는 연속체 및 적응 프로세스이다는 것을 강조합니다.
세포 생물학 및 메가카요포에이시스(12)를 특징짓는 분자 양상에 대한 지식이 증가함에 따라, 유동 세포측정에 의한 공정 연구에 전념하는 대부분의 연구는 계보별 표면 마커(즉, CD42A/B, CD41/CD61)를 이용한 성숙한 MK의 식별으로 제한되며, MK의 초기 상이한 단계는 아직 밝혀지지 않았다. 앞서 마우스골수와 골수 유래 MK배양13,14로메가카요포이스를 무대에 올리는 전략을 문서화하여인간15에적용했다. 본 기사에서는 HSC에서 성숙한 MK에 이르기까지, 인간 원(골수-BM 및 말초 혈액-PB-) 또는 MK 특이적 표면 마커(CD61, CD42B, CD4B, CD4B, CD4B) 및 CD4B9, CD4B1 을 통합하는 패널을 사용하여 체외 배양에 이르기까지 메가karyopoiesis의 특성화를 허용하는 면역페노티핑 전략을 보여줍니다. 큰 크기와 취약성에도 불구하고, MK는 전술한 세포 표면 마커를 사용하여 면역페노타입이 될 수 있으며, 세포 파열 및/또는 손상을 최소화하기 위해 특정 압력 및 노즐 직경의 특정 조건하에서 형광 활성화 셀 분류에 의해 농축될 수 있다. 이 기술은 인간의 건강과 질병에 있는 거대 karyopoiesis 및 혈소판 생산의 복잡성을 더 잘 이해하기 위하여 목적으로, 다중 Omics 접근을 촉진합니다. 주목할만한, 그것은 증가하는 수요의 임상 맥락에서 진단과 예후를 돕기 위하여 유용한 공구로 포즈를 취합니다.
이 원고에서 우리는 기본 소스에서 MK 특이적이고 비특이적 표면 마커를 통합하거나 시험관 내에서생성되는 패널로 인간 메가카요포이스를 무대에 올리는 전략을 문서화합니다. 또한, 형광 활성화 셀 선별기, 바람직한 분획 및 성숙한 MK(도1)를사용하여 분류하는 프로토콜을 제공합니다. 이 단계는 MK의 큰 크기와 취약성으로 인해 기술적으로 어렵기 때문에 인기가 없습니다. 그러나, 마우스와 인간 골수 샘플에서 이전에 사용되었으며, 기술 발전으로 인해매번 16,17,18에더 나은 결과를 초래한다. MKs 또는 MK 전구체가 연구될 수 있는 인간 적인 1차 근원은 골수, 장혈 및 말초 혈액을 포함합니다, 다른 중. 각 샘플에 대한 분석을 위해 관련 셀 분획을 격리하는 적절한 샘플 처리가 중요합니다. 표준 절차는 메가 카요포이시스의 연구를 목표로 할 때 고려해야 할 몇 가지 고려 사항과 함께 통합됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
유동 세포측정에 의한 메가카요포에이시스 연구에 초점을 맞춘 대부분의 연구는 현재까지 계보 별 표면마커(즉,CD42A/CD42B, CD41/CD61)만을 사용하여 MK 서브세트의 식별에 국한된 반면, 이전의 MK 분화 단계는 제대로 조사되지 않았습니다. 본 기사에서는 인간 메가카요포이시스의 포괄적인 유동 세포측정 특성화를 해결하기 위한 면역페노티핑 전략을 보여줍니다. 전반적으로, 우리는 보다 상세?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
마르코스 페레즈 바스테레헤아, 로레나 로드리게스 로렌조, 베고냐 가르시아 멘데스(HUCA) 및 팔로마 세레조, 알무데나 파에로, 마리아 데 라 포베다 콜로모(HCSC)에 기술 지원을 부탁드립니다. 이 작품은 의학 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다 (로슈 SP200221001) A.B., RYC 펠로우십 (RYC-2013-12587; 장관 드 Economía y 경쟁, 스페인) 및 I + D 2017 교부금 (SAF2017-85489-P; 장관 드 시엔시아, 이노바시온 y 유니버시다데스, 스페인 과 폰도스 페더) L.G., 세베로 오초아 그랜트 (PA-20-PF-BP19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades 델 Principado de Asturias, 스페인.M) 및 교내 박사 후 보조금 2018 (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Asturias – FINBA, 오비에도, 스페인) A.A.H. 우리는 자신의 지식 (및 시간), 특히 멀티 컬러 태그 항체 패널 믹스와 단일 색상 비드 제어 준비에 대한 그의 현명한 조언을 공유 레이니어 반 데르 린덴 감사합니다.
Materials
| 130 micron Nozzle | BD | 643943 | required for MK sorting |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| A-4-62 Swing Bucket Rotor | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge | ELITech Group | Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa | |
| CO2 Incubator Galaxy 170 S | Eppendorf | Cell Incubation | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | To prepare cytospins | |
| FACSAria IIu sorter | BD | Lasers 488-nm and 633-nm | |
| FACSCanto II flow cytometer | BD | Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm | |
| Olympus Microscope BX 41 | Olympus | Microphotographs | |
| Olympus Microscope BX 61 | Olympus | Microphotographs | |
| Zoe Fluorescent Cell Imager | BioRad | Microphotographs | |
| To obtain PBMCs | |||
| Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum | Sigma-Aldrich | L4646 | or similar |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07801 | or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | or similar |
| Recombinant human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | or similar |
| Recombinant human stem cell factor (SCF) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC2115 | or similar |
| Recombinant human thrombopoietin (TPO) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC9514 | or TPO receptor agonists |
| StemSpan SFEM | Stem Cell Technologies | #09650 | |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A7906-100G | or similar |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | Antibodies for human cells are generally from mouse. |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | or similar |
| BD FACS Accudrop Beads | BD | 345249 | |
| CD31 AF-647 | BD | 561654 | Mouse anti-human |
| CD31 FITC | Immunostep | 31F-100T | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | Mouse anti-human |
| CD41 PE | BD | 555467 | Mouse anti-human |
| CD41 PerCP-Cy5.5 | BD | 333148 | Mouse anti-human |
| CD42A APC | Immunostep | 42AA-100T | We observed unspecific binding… that needs to be assessed |
| CD42A PE | BD | 558819 | Mouse anti-human |
| CD42B PerCP | Biolegend | 303910 | Mouse anti-human |
| CD49B PE | BD | 555669 | Mouse anti-human |
| CD61 FITC | BD | 555753 | Mouse anti-human |
| CD71 APC-Cy7 | Biolegend | 334109 | Mouse anti-human |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | Fc blocking – control |
| KIT PE-Cy7 | Biolegend | 313212 | Mouse anti-human |
| Lineage Cocktail 2 FITC | BD | 643397 | Mouse anti-human |
| RNAse | Merck | R6513 | or similar |
| Triton X-500 | Merck | 93443-500ML | or similar |
| Cell strainers for sorting | |||
| CellTrics Filters 100 micrometers | Sysmex | 04-004-2328 | Cell strainers |
| Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols – unless otherwise specified. | |||
References
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