Automatisert, høy gjennomstrømningsdeteksjon av bakteriell overholdelse av vertsceller
Summary
Påvisning av vertsbakterielle patogeninteraksjoner basert på fenotypisk tilslutning ved bruk av fluorescensmerking med høy gjennomstrømning sammen med automatiserte statistiske analysemetoder muliggjør rask evaluering av potensielle bakterielle interaksjoner med vertsceller.
Abstract
Identifisering av nye bakterielle patogener er avgjørende for menneskers helse og sikkerhet. Bakteriell overholdelse av vertsceller er et viktig skritt i bakterielle infeksjoner og utgjør et kjennetegn på potensiell trussel. Derfor kan det å undersøke overholdelse av bakterier til vertsceller brukes som en komponent i bakteriell trusselvurdering. En standardmetode for å liste opp bakteriell overholdelse av vertsceller er å co-inkubere bakterier med vertsceller, høste de tilhørende bakteriene, plate de høstede cellene på faste medier, og deretter telle de resulterende kolonidannende enhetene (CFU). Alternativt kan bakteriell overholdelse av vertsceller evalueres ved hjelp av immunfluorescensmikroskopibaserte tilnærminger. Konvensjonelle strategier for implementering av disse tilnærmingene er imidlertid tidkrevende og ineffektive. Her beskrives en nylig utviklet automatisert fluorescensmikroskopibasert avbildningsmetode. Når metoden kombineres med bildebehandling med høy gjennomstrømning og statistisk analyse, muliggjør den rask kvantifisering av bakterier som holder seg til vertsceller. To bakteriearter, Gram-negative Pseudomonas aeruginosa og Gram-positive Listeria monocytogenes og tilsvarende negative kontroller, ble testet for å demonstrere protokollen. Resultatene viser at denne tilnærmingen raskt og nøyaktig nummererer tilhengerbakterier og reduserer eksperimentelle arbeidsbelastninger og tidslinjer betydelig.
Introduction
Bakteriell vedheft er en prosess der bakterier festes til andre celler eller overflater. Vellykket etablering av infeksjon ved bakterielle patogener krever vedheft for å være vert for celler, kolonisering av vev, og i noen tilfeller invasjon av vertsceller1,2,3. Nye smittsomme sykdommer utgjør store folkehelsetrusler, som det fremgår av den nylige COVID-19-pandemien4,5,6. Det er viktig at nye eller nye patogener ikke lett kan ses ved hjelp av genombaserte tilnærminger, spesielt i tilfeller der patogenet er konstruert for å unngå deteksjon eller ikke inneholder genomiske signaturer som identifiserer det som patogent. Derfor kan identifisering av potensielle patogener ved hjelp av metoder som direkte vurderer kjennetegn på patogenisitet, som bakteriell overholdelse av vertsceller, spille en kritisk rolle i patogenidentifikasjon.
Bakteriell overholdelse av vertsceller har blitt brukt til å evaluere mekanismer for bakteriell patogenese i flere tiår1,7. Mikroskopisk avbildning8,9 og opplisting av bakteriell kolonidannende enhet (CFU)10,11,12,13 ved etterinfeksjonsbelegg er to velutviklede laboratoriemetoder for testing av mikrobiell tilslutning og/eller infeksjon av vertsceller14. Tatt i betraktning mikrometerskalastørrelsen på bakterieceller, krever opplistingen av de tilhørende bakteriecellene generelt bruk av avanserte mikroskopiteknikker med høy forstørrelse, samt høyoppløselige bildebehandlingsmetoder, inkludert elektronmikroskopi, ekspansjonsmikroskopi (ExM)15,16og tredimensjonal avbildning17 . Alternativt kan opplistingen av bakterier bundet til eller internalisert i vertsceller utføres ved å plating fortynningsserien av høstede bakterier på fast agar og telle de resulterende CFUs10,12,13. Denne metoden er arbeidskrevende og inneholder mange manuelle trinn, som introduserer vanskeligheter med å etablere en standardisert eller automatisert prosedyre som kreves for høygjennomstrømningsanalyser18,19. Derfor vil utviklingen av nye metoder for evaluering av vertscellevedlegg adressere gjeldende begrensninger i feltet.
En slik metode er beskrevet her som bruker automatisert mikroskopi med høy gjennomstrømning, kombinert med høy gjennomstrømningsbildebehandling og statistisk analyse. For å demonstrere tilnærmingen ble eksperimenter med flere bakterielle patogener utført, inkludert Pseudomonas aeruginosa, et opportunistisk Gram-negativ bakteriell patogen av mennesker, dyr og planter14,20, som ofte antas å kolonisere luftveiene til pasienter med nedsatt vertsforsvarsfunksjoner. Denne tilnærmingen optimaliserte den mikroskopiske bildebehandlingsprosessen beskrevet i tidligere studier14,20. Avbildningsdeteksjonen ble forenklet av fluorescensmerkede vertsceller og bakterier for raskt å spore nærheten til dem, noe som dramatisk reduserte mikroskopiarbeidsbelastningen for å få høyoppløselige bilder for å skille bakterier. I tillegg erstattet den automatiserte statistiske analysen av bilder i telling av vertsceller og bakterier hånd-på-eksperimentet av bakteriell CFU-plating for å estimere forholdet mellom tilhenger bakterietall per vertscelle. For å bekrefte kompatibiliteten til denne metoden har flere bakteriestammer og vertscelletyper også blitt testet, som Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus og Klebsiella pneumoniae, samt humane navlestrengs endothelialceller (HUVECs), og resultatene støtter mangfoldet og effektiviteten av metoden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskriver en automatisert tilnærming for opplisting av bakteriell vedlegg til vertsceller. Den beskrevne tilnærmingen har flere attraktive fordeler i forhold til konvensjonelle metoder. For det første muliggjør denne tilnærmingen nøyaktig kvantifisering av antall mikrobielle patogenceller som er festet til individuelle vertsceller. Viktigst, denne kvantifiseringen kan utføres uten behov for arbeidskrevende bakteriell høsting, serielle fortynninger, plating på faste medier og bestemmelse av CFUer<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige til Dr. Kaite Zlotkowski fra Biotek Inc. for deres tekniske støtte. Dette arbeidet ble støttet av Forsvarsdepartementet under kontraktsnummer W911NF1920013 til PdF, Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) og Department of Interior under Contract No. 140D6319C0029 til PdF. Innholdet i informasjonen gjenspeiler ikke nødvendigvis regjeringens posisjon eller politikk, og ingen offisiell tilslutning bør utledes.
Materials
| 10x PBS | VWR | 45001-130 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | 62248 | Host cell staining dye |
| 96 well plate | Corning | 3882 | Half area well, flat clear bottom |
| A549 cells | ATCC | CCL 185 | Mammalian cell line |
| BactoView Live Red | Biotium | 40101 | Bacteria staning dye |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| CFSE cell division tracker | BioLegend | 423801 | |
| Cytation 5 | BioTek | Cytation 5 | Cell imaging multi-mode reader |
| E. coli | Laboratory stock | ||
| EGM bulletKit | Lonza | CC-3124 | HUVEC cell culture medium |
| EHEC | NIST collections | ||
| F-12k medium | ATCC | 302004 | A549 cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-016-CV | |
| HUVEC | Laboratory stock | ||
| L. monocytogenes | NIST collections | ||
| OD600 DiluPhotometer | IMPLEN | ||
| P. aeruginosa | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| P. aeruginosa ΔpilA | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| S. agalactiae | NIST collections | ||
| S. aureus | BEI | NR-46543 | |
| S. aureus ΔsaeR | BEI | NR-48164 | |
| S. rubidaea | NIST collections | ||
| Typical soy broth | Growcells | MBPE-4040 |
References
- Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 124, 715-727 (2006).
- Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).
- Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
- Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Craxì, A. SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver. Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).
- Ortiz-Prado, E., et al. Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).
- Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19. Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).
- Woo, V., et al. Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression. Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).
- Pandey, A., et al. Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection. Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).
- Ding, S., et al. Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes. iScience. 24 (3), 102192 (2021).
- Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).
- Qin, Q. M., et al. Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).
- Qin, Q. M., et al. A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).
- Pandey, A., et al. Activation of host IRE1α-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).
- Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells. Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).
- Götz, R., et al. Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy. Nature Communications. 11, 6173 (2020).
- Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).
- Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).
- Hoffmann, S., et al. High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).
- Hazan, R., Que, Y. -. A., Maura, D., Rahme, L. G. A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates. BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).
- Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).
- Farinha, M. A., et al. Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice. Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).
- Réglier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes. Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).
- Ortega, F. E., et al. Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).
