Détection automatisée et à haut débit de l’adhérence bactérienne aux cellules hôtes
Summary
La détection des interactions pathogènes hôte-bactérien basée sur l’adhérence phénotypique à l’aide de l’imagerie de marquage par fluorescence à haut débit ainsi que de méthodes d’analyse statistique automatisées permet une évaluation rapide des interactions bactériennes potentielles avec les cellules hôtes.
Abstract
L’identification des agents pathogènes bactériens émergents est essentielle à la santé et à la sécurité humaines. L’adhésion bactérienne aux cellules hôtes est une étape essentielle dans les infections bactériennes et constitue une marque de menace potentielle. Par conséquent, l’examen de l’adhérence des bactéries aux cellules hôtes peut être utilisé comme composante de l’évaluation de la menace bactérienne. Une méthode standard pour dénombrer l’adhérence bactérienne aux cellules hôtes consiste à co-incuber les bactéries avec les cellules hôtes, à récolter les bactéries adhérentes, à plaquer les cellules récoltées sur des milieux solides, puis à compter les unités formant des colonies (UFC) résultantes. Alternativement, l’adhérence bactérienne aux cellules hôtes peut être évaluée à l’aide d’approches basées sur la microscopie à immunofluorescence. Cependant, les stratégies conventionnelles de mise en œuvre de ces approches prennent beaucoup de temps et sont inefficaces. Ici, une méthode d’imagerie automatisée basée sur la microscopie à fluorescence récemment développée est décrite. Lorsqu’elle est combinée avec un traitement d’image à haut débit et une analyse statistique, la méthode permet une quantification rapide des bactéries qui adhèrent aux cellules hôtes. Deux espèces bactériennes, Pseudomonas aeruginosa à Gram négatif et Listeria monocytogenes à Gram positif et les témoins négatifs correspondants, ont été testées pour démontrer le protocole. Les résultats montrent que cette approche dénombre rapidement et avec précision les bactéries adhérentes et réduit considérablement les charges de travail et les délais expérimentaux.
Introduction
L’adhésion bactérienne est un processus par lequel les bactéries se fixent à d’autres cellules ou surfaces. L’établissement réussi de l’infection par des agents pathogènes bactériens nécessite l’adhésion aux cellules hôtes, la colonisation des tissus et, dans certains cas, l’invasion des cellules hôtes1,2,3. Les maladies infectieuses émergentes constituent des menaces majeures pour la santé publique, comme en témoigne la récente pandémie deCOVID-19 4,5,6. Il est important de noter que les agents pathogènes nouveaux ou émergents peuvent ne pas être facilement discernés à l’aide d’approches génomiques, en particulier dans les cas où l’agent pathogène a été conçu pour échapper à la détection ou ne contient pas de signatures génomiques qui l’identifient comme pathogène. Par conséquent, l’identification d’agents pathogènes potentiels à l’aide de méthodes qui évaluent directement les caractéristiques de la pathogénicité, comme l’adhérence bactérienne aux cellules hôtes, peut jouer un rôle essentiel dans l’identification des agents pathogènes.
L’adhérence bactérienne aux cellules hôtes a été utilisée pour évaluer les mécanismes de pathogenèse bactérienne pendant les décennies1,7. L’imagerie microscopique8,9 et le dénombrement de l’unité de formation de colonies bactériennes (UFC)10,11,12,13 par placage post-infection sont deux méthodes de laboratoire bien développées pour tester l’adhérence microbienne et / ou l’infection des cellules hôtes14. Compte tenu de la taille micrométrique des cellules bactériennes, le dénombrement des cellules bactériennes adhérentes nécessite généralement l’utilisation de techniques avancées de microscopie à fort grossissement, ainsi que d’approches d’imagerie à haute résolution, y compris la microscopie électronique, la microscopie à expansion (ExM)15,16et l’imagerie tridimensionnelle17 . Alternativement, le dénombrement des bactéries liées ou internalisées dans les cellules hôtes peut être effectué en plaquant la série de dilution des bactéries récoltées sur une gélose solide et en comptant les UFC résultantes10,12,13. Cette méthode est laborieuse et comprend de nombreuses étapes manuelles, ce qui introduit des difficultés dans l’établissement d’une procédure standardisée ou automatisée requise pour les analyses à haut débit18,19. Par conséquent, l’élaboration de nouvelles méthodes d’évaluation de l’attachement des cellules hôtes permettrait de remédier aux limites actuelles dans le domaine.
Une telle méthode est décrite ici qui utilise la microscopie automatisée à haut débit, combinée au traitement d’images à haut débit et à l’analyse statistique. Pour démontrer l’approche, des expériences avec plusieurs agents pathogènes bactériens ont été effectuées, y compris Pseudomonas aeruginosa, un pathogène bactérien opportuniste à Gram négatif des humains, des animaux et des plantes14,20, qui colonise fréquemment les voies respiratoires de patients présentant des fonctions de défense de l’hôte altérées. Cette approche a optimisé le processus d’imagerie microscopique décrit dans les études précédentes14,20. La détection par imagerie a été simplifiée par des cellules hôtes et des bactéries marquées par fluorescence pour suivre rapidement leur proximité, ce qui a considérablement réduit la charge de travail de microscopie pour obtenir des images haute résolution permettant de distinguer les bactéries. En outre, l’analyse statistique automatisée des images dans le comptage des cellules hôtes et des bactéries a remplacé l’expérience pratique du placage bactérien CFU pour estimer le rapport du nombre de bactéries adhérentes par cellule hôte. Pour confirmer la compatibilité de cette méthode, plusieurs souches bactériennes et types de cellules hôtes ont également été testés, comme Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus et Klebsiella pneumoniae, ainsi que des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC), et les résultats soutiennent la diversité et l’efficacité de la méthode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit une approche automatisée pour dénombrer l’attachement bactérien aux cellules hôtes. L’approche décrite présente plusieurs avantages intéressants par rapport aux méthodes conventionnelles. Tout d’abord, cette approche permet de quantifier avec précision le nombre de cellules pathogènes microbiennes attachées à des cellules hôtes individuelles. Il est important de noter que cette quantification peut être effectuée sans avoir besoin d’une récolte bactérienne laborieuse, de dilut…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants au Dr Kaite Zlotkowski de Biotek Inc. pour son soutien technique. Ce travail a été soutenu par le ministère de la Défense sous le numéro de contrat W911NF1920013 à PdF, la Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) et le ministère de l’Intérieur sous le numéro de contrat 140D6319C0029 à PdF. Le contenu de l’information ne reflète pas nécessairement la position ou la politique du gouvernement, et aucune approbation officielle ne devrait être déduite.
Materials
| 10x PBS | VWR | 45001-130 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | 62248 | Host cell staining dye |
| 96 well plate | Corning | 3882 | Half area well, flat clear bottom |
| A549 cells | ATCC | CCL 185 | Mammalian cell line |
| BactoView Live Red | Biotium | 40101 | Bacteria staning dye |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| CFSE cell division tracker | BioLegend | 423801 | |
| Cytation 5 | BioTek | Cytation 5 | Cell imaging multi-mode reader |
| E. coli | Laboratory stock | ||
| EGM bulletKit | Lonza | CC-3124 | HUVEC cell culture medium |
| EHEC | NIST collections | ||
| F-12k medium | ATCC | 302004 | A549 cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-016-CV | |
| HUVEC | Laboratory stock | ||
| L. monocytogenes | NIST collections | ||
| OD600 DiluPhotometer | IMPLEN | ||
| P. aeruginosa | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| P. aeruginosa ΔpilA | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| S. agalactiae | NIST collections | ||
| S. aureus | BEI | NR-46543 | |
| S. aureus ΔsaeR | BEI | NR-48164 | |
| S. rubidaea | NIST collections | ||
| Typical soy broth | Growcells | MBPE-4040 |
References
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