זיהוי אוטומטי בעל תפוקה גבוהה של דבקות חיידקית בתאים מארחים
Summary
זיהוי של אינטראקציות פתוגן מארח-חיידקי המבוסס על דבקות פנוטיפית באמצעות הדמיית תיוג פלואורסצנטית בעלת תפוקה גבוהה יחד עם שיטות ניתוח סטטיסטיות אוטומטיות מאפשר הערכה מהירה של אינטראקציות חיידקיות פוטנציאליות עם תאים מארחים.
Abstract
זיהוי של פתוגנים חיידקיים מתעוררים הוא קריטי לבריאות וביטחון האדם. דבקות חיידקית בתאים מארחים היא צעד חיוני בזיהומים חיידקיים ומהווה סימן היכר של איום פוטנציאלי. לכן, בחינת דבקותם של חיידקים לתאים מארחים יכולה לשמש כמרכיב של הערכת איום חיידקי. שיטה סטנדרטית לספירת דבקות חיידקית לתאים מארחים היא להדגיר יחד חיידקים עם תאים מארחים, לקצור את החיידקים החסידים, צלחת התאים שנקטפו על מדיה מוצקה, ולאחר מכן לספור את המושבה שנוצרת יחידות יוצרות (CFU). לחלופין, דבקות חיידקית בתאים מארחים ניתן להעריך באמצעות גישות מבוססות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית. עם זאת, אסטרטגיות קונבנציונליות ליישום גישות אלה גוזלות זמן ולא יעילות. כאן, פותחה לאחרונה שיטת הדמיה אוטומטית המבוססת על מיקרוסקופיה. בשילוב עם עיבוד תמונה בעל תפוקה גבוהה וניתוח סטטיסטי, השיטה מאפשרת כימות מהיר של חיידקים הנצמדים לתאים מארחים. שני מינים חיידקיים, פסאודומונס ארוגינוזה גרם-חיובי מונוציטוגנים ופקדים שליליים תואמים, נבדקו כדי להדגים את הפרוטוקול. התוצאות מראות כי גישה זו מהווה נדבך במהירות ובדייקנות ומצטרפת באופן משמעותי את עומסי העבודה וצירי הזמן הניסיוניים.
Introduction
הידבקות חיידקית היא תהליך לפיו חיידקים מתחברים לתאים או למשטחים אחרים. הקמה מוצלחת של זיהום על ידי פתוגנים חיידקיים דורשת הידבקות לתאים מארחים, קולוניזציה של רקמות, ובמקרים מסוימים, פלישה לתאים מארחים1,2,3. מחלות זיהומיות מתפתחות מהוות איומים גדולים על בריאות הציבור, כפי שמעידת מגפת COVID-19 האחרונה4,5,6. חשוב לציין, פתוגנים חדשים או מתעוררים לא ניתן להבחין בקלות באמצעות גישות מבוססות גנומיות, במיוחד במקרים שבהם הפתוגן תוכנן להתחמק מזיהוי או אינו מכיל חתימות גנומיות המזהות אותו פתוגניים. לכן, זיהוי של פתוגנים פוטנציאליים באמצעות שיטות המעריכות ישירות סימני היכר של פתוגניות, כמו דבקות חיידקית בתאים מארחים, יכול לשחק תפקיד קריטי בזיהוי פתוגן.
דבקות חיידקית לתאים מארחים שימשה להערכת מנגנונים של פתוגנזה חיידקית במשךעשרות שנים 1,7. הדמיה מיקרוסקופית8,9 והספירה של יחידת יצירת מושבה חיידקית (CFU)10,11,12,13 על ידי ציפוי לאחר זיהום הן שתי שיטות מעבדה מפותחות לבדיקת דבקות מיקרוביאלית ו / או זיהום של תאים מארחים14. בהתחשב בגודל קנה המידה של תאי החיידקים, חלוקת תאי החיידקים החסידים דורשת בדרך כלל שימוש בטכניקות מיקרוסקופיות מתקדמות בהגדלה גבוהה, כמו גם בגישות הדמיה ברזולוציה גבוהה, כולל מיקרוסקופיה אלקטרונית, מיקרוסקופיה הרחבה (ExM)15,16והדמיה תלת ממדית17 . לחלופין, ספירת חיידקים הקשורים או מופנמים בתוך תאים מארחים יכולה להתבצע על ידי ציפוי סדרת הדילול של חיידקים שנקטפו על אגר מוצק וספירת CFUs10,12,13. שיטה זו היא מייגע וכוללת צעדים ידניים רבים, אשר מציג קשיים בקביעת הליך סטנדרטי או אוטומטי הנדרש לניתוחים בעלי תפוקה גבוהה18,19. לכן, פיתוח שיטות חדשות להערכת קובץ מצורף לתא מארח יטפל במגבלות הנוכחיות בשדה.
שיטה אחת כזו מתוארת כאן המשתמשת במיקרוסקופיה אוטומטית של תפוקה גבוהה, בשילוב עם עיבוד תמונה בתפוקה גבוהה וניתוח סטטיסטי. כדי להדגים את הגישה, בוצעו ניסויים עם מספר פתוגנים חיידקיים, כולל פסאודומונס ארוגינוזה, פתוגן חיידקי גרם שלילי אופורטוניסטי של בני אדם, בעלי חיים וצמחים14,20, אשר נמצא לעתים קרובות ליישב את דרכי הנשימה של חולים עם תפקודי הגנה מארח לקוי. גישה זו מיטבה את תהליך ההדמיה המיקרוסקופית המתוארת במחקרים קודמים14,20. זיהוי ההדמיה היה פשוט יותר על ידי תאים מארחים ובקטריה המסומנים על ידי פלואורסצנטיות כדי לעקוב במהירות אחר הקרבה שלהם, מה שהפחית באופן דרמטי את עומס העבודה של המיקרוסקופיה כדי לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה עבור חיידקים ייחודיים. בנוסף, הניתוח הסטטיסטי האוטומטי של תמונות בספירת תאים מארחים וחיידקים החליף את הניסוי הידני של ציפוי CFU חיידקי כדי להעריך את היחס בין ספירת חיידקים חסידים לתא מארח. כדי לאשר את התאימות של שיטה זו, זנים חיידקיים מרובים וסוגי תאים מארחים נבדקו גם, כמו ליסטריה מונוציטוגנים, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, ו Klebsiella דלקת ריאות, כמו גם תאי אנדותל וריד הטבור האנושי (HUVECs), והתוצאות תומכות במגוון וביעילות של השיטה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול מתאר גישה אוטומטית לספירת התקשרות חיידקית לתאים מארחים. לגישה המתוארת יש כמה יתרונות אטרקטיביים על פני שיטות קונבנציונליות. ראשית, גישה זו מאפשרת כימות מדויק של מספר תאי הפתוגן המיקרוביאליים המחוברים לתאים מארחים בודדים. חשוב לציין, כימות זה יכול להתבצע ללא צורך בקציר חיידקים ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר קייט זלוטוקובסקי מ-Biotek Inc. על תמיכתם הטכנית. עבודה זו נתמכה על ידי משרד ההגנה תחת חוזה מספר W911NF1920013 ל- PdF, הסוכנות לפרויקטי מחקר מתקדמים של ההגנה (DARPA) ומשרד הפנים תחת חוזה מס ‘140D6319C0029 ל- PdF. תוכן המידע אינו משקף בהכרח את עמדת הממשלה או את מדיניותה, ואין להסיק כל אישור רשמי.
Materials
| 10x PBS | VWR | 45001-130 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | 62248 | Host cell staining dye |
| 96 well plate | Corning | 3882 | Half area well, flat clear bottom |
| A549 cells | ATCC | CCL 185 | Mammalian cell line |
| BactoView Live Red | Biotium | 40101 | Bacteria staning dye |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| CFSE cell division tracker | BioLegend | 423801 | |
| Cytation 5 | BioTek | Cytation 5 | Cell imaging multi-mode reader |
| E. coli | Laboratory stock | ||
| EGM bulletKit | Lonza | CC-3124 | HUVEC cell culture medium |
| EHEC | NIST collections | ||
| F-12k medium | ATCC | 302004 | A549 cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-016-CV | |
| HUVEC | Laboratory stock | ||
| L. monocytogenes | NIST collections | ||
| OD600 DiluPhotometer | IMPLEN | ||
| P. aeruginosa | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| P. aeruginosa ΔpilA | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| S. agalactiae | NIST collections | ||
| S. aureus | BEI | NR-46543 | |
| S. aureus ΔsaeR | BEI | NR-48164 | |
| S. rubidaea | NIST collections | ||
| Typical soy broth | Growcells | MBPE-4040 |
References
- Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 124, 715-727 (2006).
- Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).
- Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
- Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Craxì, A. SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver. Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).
- Ortiz-Prado, E., et al. Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).
- Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19. Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).
- Woo, V., et al. Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression. Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).
- Pandey, A., et al. Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection. Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).
- Ding, S., et al. Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes. iScience. 24 (3), 102192 (2021).
- Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).
- Qin, Q. M., et al. Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).
- Qin, Q. M., et al. A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).
- Pandey, A., et al. Activation of host IRE1α-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).
- Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells. Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).
- Götz, R., et al. Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy. Nature Communications. 11, 6173 (2020).
- Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).
- Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).
- Hoffmann, S., et al. High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).
- Hazan, R., Que, Y. -. A., Maura, D., Rahme, L. G. A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates. BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).
- Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).
- Farinha, M. A., et al. Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice. Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).
- Réglier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes. Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).
- Ortega, F. E., et al. Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).
