ניתוח עקה חמצונית באורגנוידים מעיים מורין באמצעות גשושית פלואורוגנית רגישה למינים של חמצן תגובתי
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לזיהוי מינים של חמצן תגובתי (ROS) באורגנוידים של מורין במעיים באמצעות הדמיה איכותית ובדיקות ציטומטריה כמותית. עבודה זו יכולה להיות מורחבת באופן פוטנציאלי לבדיקות פלואורסצנטיות אחרות כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות נבחרות על ROS.
Abstract
מינים חמצן תגובתי (ROS) לשחק תפקידים חיוניים הומאוסטזיס מעיים. ROS הם תוצרי לוואי טבעיים של חילוף החומרים של התא. הם מיוצרים בתגובה לזיהום או פציעה ברמה הרירית כפי שהם מעורבים בתגובות מיקרוביאלית וריפוי פצעים. הם גם שליחים משניים קריטיים, ויסות מספר מסלולים, כולל צמיחת תאים ובידול. מצד שני, רמות ROS מוגזמות להוביל עקה חמצונית, אשר יכול להיות מזיק לתאים לטובת מחלות מעיים כמו דלקת כרונית או סרטן. עבודה זו מספקת שיטה פשוטה כדי לזהות ROS באורגנוידים מורין מעיים על ידי הדמיה חיה וציטומטריית זרימה, באמצעות בדיקה פלואורוגנית זמינה מסחרית. כאן הפרוטוקול מתאר את ההשפעה של תרכובות המווסתות את איזון redox באורגנוידים במעיים ולזהות רמות ROS בסוגי תאי מעיים ספציפיים, המודגמים כאן על ידי ניתוח של תאי גזע מעיים המסומנים גנטית עם GFP. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עם בדיקות פלואורסצנטיות אחרות.
Introduction
מינים חמצן תגובתי (ROS) הם תוצרי לוואי טבעיים של חילוף החומרים התאי. הם יכולים גם להיות מיוצרים באופן פעיל על ידי קומפלקסים אנזימטיים מיוחדים כגון NADPH-Oxidases הקשורים לממברנה (NOX) ו Oxidases כפול (DUOX), אשר מייצרים אניון סופראוקסיד ומי חמצן1. על ידי הבעת אנזימים נוגדי חמצון ואוכלי נבלות ROS, תאים יכולים לכוונן דק את איזון ה- redox שלהם, ובכך להגן על הומאוסטזיס רקמות2. למרות ROS יכול להיות רעיל מאוד לתאים ולפגוע DNA, חלבונים, שומנים, שומנים, הם מולקולות איתות חיוני2. באפיתל המעיים, רמות ROS מתונות נדרשות להתפשטות תאי גזע ואבות אבות3; רמות ROS גבוהות להוביל אפופטוזיס שלהם4. עקה חמצונית כרונית קשורה למחלות רבות במערכת העיכול, כגון מחלות מעי דלקתיות או סרטן. כדוגמה, במודל עכבר של סרטן מעיים מונחה Wnt, ייצור ROS מוגבר באמצעות הפעלה של NADPH-oxidases נמצאה כנדרשת עבור תאים סרטניים hyperproliferation5,6. הגדרת האופן שבו תאי מעיים, בפרט תאי גזע, תאי גזע מנהלים עקה חמצונית וכיצד הסביבה התאית יכולה להשפיע על יכולת זו חיונית כדי להבין את האטיולוגיה של מחלה זו טוב יותר7.
ברקמה, סוגי תאים שונים מציגים מצב חמצוני בסיסי שעשוי להשתנות בהתאם לתפקודם ולחילוף החומרים שלהם ולביטוי של רמות משתנות של מולקולות חמצון ונוגדי חמצון4,7. ניטור ROS ב vivo הוא מאתגר מאוד. צבעים חדירים לתאים הפולטים פלואורסצנטיות בהתאם למצבם האדום פותחו כדי לדמיין ולמדוד ROS תאי בתאים חיים ובבעלי חיים. עם זאת, היעילות שלהם תלויה בפיזור שלהם בתוך רקמות חיות ואת הקריאה המהירה שלהם, מה שהופך אותם קשים לשימוש במודלים של בעלי חיים8.
בעבר, המחקר של ההשפעה של תרכובות על דור ROS נעשה באמצעות קווי תאים, אבל זה לא יכול לשקף את המצב in vivo . מודל האורגנויד במעיים, שפותח על ידי קבוצת Clevers9, מאפשר את הצמיחה של תאים ראשוניים במעיים ex vivo. תרבות של קריפטות מעיים במטריצות, בנוכחות גורמי גדילה מוגדרים, מובילה למבנים תלת-ממדיים, הנקראים אורגנוידים (מיני-מעיים), אשר משחזרים את ארגון הקריפטה-וילון, עם תאים משושלות האפיתל השונות המצפות לומן פנימי, ותאי הגזע במעיים המתגוררים בבליטה קטנה דמוית קריפטה.
כאן, תוך ניצול מודל זה, מתוארת שיטה פשוטה לחקר עקה חמצונית בתאי מעיים ראשוניים ברזולוציה של תא יחיד על ידי הוספת צבע רגיש ל- ROS זמין מסחרית למדיום התרבות האורגנויד.
קוראי לוחות משמשים לעתים קרובות כדי לזהות ייצור ROS באוכלוסייה הכוללת. פרוטוקול זה משתמש בציטומטריית זרימה או בבדיקת הדמיה כדי לזהות ROS בסוג תא מסוים עם תאים מהונדסים גנטית או כתמי נוגדנים ספציפיים. עבודה זו כוללת תרבות אורגנויד מעיים של עכבר והדמיה ROS על ידי הדמיה קונפוקלית וכימות על ידי ציטומטריית זרימה. באמצעות Lgr5-GFP עכברים נגזרים אורגנוידים מעיים קטנים, ניתן לנתח באופן ספציפי את רמת הלחץ החמצוני בתאי גזע מעיים על טיפולים שונים. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי לבדוק את ההשפעה של מולקולות אקסוגניות, כגון מראמיל-dipeptide נגזר מיקרוביוטה (MDP)10, על מאזן ROS, לאחר גירוי organoids עם התרכובות שנבחרו.
Protocol
Representative Results
Discussion
עבודה זו מספקת פרוטוקול שלב אחר שלב כדי לבודד קריפטות jejunal murine, תרבית אותם לתוך organoids 3D, ולנתח ROS organoids על ידי שילוב בדיקה פלואורוגנית רגישה ROS עם הדמיה מיקרוסקופית איכותית של organoids שלמים ומדידת ROS כמותית באמצעות cytometry זרימה על תאים בודדים בעקבות דיסוציאציה organoid.
הצעד הקריטי הר?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR) 17-CE14-0022 (i-Stress).
Materials
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
- Aviello, G., Knaus, U. G. NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article. Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).
- Holmström, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
- vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation. Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
- Myant, K. B., et al. ROS production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
- Juhasz, A., et al. NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction. Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).
- Aviello, G., Knaus, U. G. ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage. British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).
- Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Levy, A., et al. Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).
- Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death. Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).
- Ahn, H. Y., et al. Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides. Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).
- Bidaux, G., et al. Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).
- Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).
- Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model. Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
