活性酸素種感受性蛍光発生プローブを用いたマウス腸管オルガノイドの酸化ストレス解析
Summary
本プロトコールは、定性的イメージングおよび定量的サイトメトリーアッセイを用いて腸マウスオルガノイド中の活性酸素種(ROS)を検出する方法を記載する。この研究は、選択された化合物がROSに及ぼす影響を試験するために、他の蛍光プローブに拡張される可能性があります。
Abstract
活性酸素種(ROS)は、腸の恒常性維持に不可欠な役割を果たす。ROSは細胞代謝の天然の副産物である。それらは、抗菌応答および創傷治癒に関与するので、粘膜レベルでの感染または傷害に応答して産生される。それらはまた、重要な二次メッセンジャーであり、細胞の成長および分化を含むいくつかの経路を調節する。一方、過剰なROSレベルは酸化ストレスをもたらし、これは細胞にとって有害であり、慢性炎症または癌のような腸疾患に有利であり得る。この研究は、市販の蛍光発生プローブを用いたライブイメージングおよびフローサイトメトリーによって腸内マウスオルガノイド中のROSを検出する簡単な方法を提供する。ここでのプロトコールは、GFPで遺伝的に標識された腸幹細胞の分析によってここに例示される、腸オルガノイドにおける酸化還元バランスを調節し、特定の腸細胞型におけるROSレベルを検出する化合物の効果をアッセイすることを記載する。このプロトコルは、他の蛍光プローブと共に使用され得る。
Introduction
活性酸素種(ROS)は、細胞代謝の天然の副産物である。また、膜結合型NADPH-オキシダーゼ(NOX)やデュアルオキシダーゼ(DUOX)などの特殊な酵素複合体によっても積極的に生成でき、スーパーオキシドアニオンと過酸化水素を生成します1。抗酸化酵素とROSスカベンジャーを発現させることにより、細胞は酸化還元バランスを微調整し、組織の恒常性を保護することができます2。ROSは細胞に対して非常に毒性が高く、DNA、タンパク質、脂質に損傷を与える可能性がありますが、それらは重要なシグナル伝達分子です2。腸上皮では、幹および前駆細胞の増殖に中等度のROSレベルが必要です3。高いROSレベルは、アポトーシスにつながります4。慢性酸化ストレスは、炎症性腸疾患や癌などの多くの胃腸疾患に関連しています。一例として、Wnt駆動型腸癌のマウスモデルにおいて、NADPHオキシダーゼの活性化によるROS産生の上昇が癌細胞の過剰増殖に必要であることが判明した5,6。腸細胞、特に幹細胞、幹細胞が酸化ストレスをどのように管理し、細胞環境がこの能力にどのように影響するかを定義することは、この病気の病因をよりよく理解するために不可欠です7。
組織において、異なる細胞型は、その機能および代謝、ならびに様々なレベルの酸化分子および抗酸化分子の発現に応じて変化し得る基礎酸化状態を提示する4,7。インビボでのROSモニタリングは非常に困難です。酸化還元状態に応じて蛍光を発する細胞透過性色素は、生細胞や動物における細胞ROSを可視化・測定するために開発されている。しかし、その有効性は、生体組織内での拡散と迅速な読み出しに依存しているため、動物モデルでの使用が困難です8。
過去には、ROS生成に対する化合物の効果の研究は細胞株を用いて行われていたが、これはin vivoの状況を反映していない可能性がある。Clevers9のグループによって開発された腸オルガノイドモデルは、腸の初代細胞のエクスビボでの増殖を可能にする。定義された成長因子の存在下でのマトリックス中の腸陰窩の培養は、オルガノイド(ミニ腸)と呼ばれる三次元構造をもたらし、異なる上皮系統からの細胞が内部管腔を裏打ちし、腸幹細胞が小さな陰窩様突起に存在する陰窩絨毛組織を再現する。
ここでは、このモデルを利用して、市販のROS感受性色素をオルガノイド培地に添加することにより、初代腸管細胞の酸化ストレスを単一細胞分解能で調べる簡便な方法について説明する。
プレートリーダーは、全集団におけるROS産生を検出するためによく使用されます。このプロトコルは、フローサイトメトリーまたはイメージングアッセイを使用して、遺伝子改変細胞または特定の抗体染色を用いて特定の細胞型におけるROSを検出する。この研究は、マウス腸管オルガノイド培養と共焦点イメージングによるROS可視化、フローサイトメトリーによる定量化を含む。Lgr5-GFPマウス由来小腸オルガノイドを用いて、異なる治療を受けた際の腸管幹細胞における酸化ストレスのレベルを特異的に解析することができる。このプロトコルは、選択した化合物でオルガノイドを刺激した後、微生物叢由来のムラミルジペプチド(MDP)10などの外因性分子がROSバランスに及ぼす影響をテストするために適合させることができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究は、マウスの空腸陰窩を単離し、それらを3Dオルガノイドに培養し、ROS感受性蛍光発生プローブとオルガノイド全体の定性顕微鏡イメージングおよびオルガノイド解離後の単一細胞に対するフローサイトメトリーを用いた定量的ROS測定と組み合わせることによって、オルガノイド中のROSを分析するための段階的なプロトコルを提供する。
この方法の最初の重要な…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、フランス国立研究機関(ANR)の助成金17-CE14-0022(i-Stress)によって支援されました。
Materials
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
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